【精品】PCR理论文档

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1、PCR技术简史[2007-8-2718:06:00

2、By:biosou]PCR技术简史PCR的最早设想核酸研究已冇100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便口J克隆tRNA基因”。PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具冇划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外

3、合成提供以致一种合适的条件…摸板DNA,寡核甘酸引物,DNA聚合晦，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与吋间。PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：©Klenow酶不耐高温，90°C会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延仲反应在37°C下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow嗨催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于KIenow酶不耐热，在DN

4、A模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)屮捉取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70°C下反应2h后其残留活性大于原来的90

5、%,在93°C下反应2h后其残留活性是原来的60%,在95°C下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于捉高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大捉高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)o此酶的发现使PCR广泛的被应用。PCR技术的基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补

6、的寡核营酸引物。PCR由变性-退火“延仲三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93°C左右-•定吋间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合晦的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的

7、半保留复制链重复循环变性-退火-延仲三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链乂可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2〜4分钟，2〜3小吋就能将待扩口的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)o到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(丫)均毎次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应屮平均效率达不到理

8、论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5,端Z间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是曲•引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在笫一个反应周期中，以两条

9、互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没冇固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，述耍同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结时，由于新链模板的5端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看岀“短产物片段”