烟草钟器腐霉的分子鉴定与致病力测定

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1、烟草钟器腐霉的分子鉴定与致病力测定边传红1，王伟杰2，赵世民3，康业斌1（1河南科技大学林学院，河南洛阳471003；2洛阳市烟草公司嵩县支公司，河南嵩县471400；3河南省烟草公司洛阳市公司，河南洛阳471023）摘要：从河南省嵩县送检的烟草茎黑腐病样本上分离获得1株腐霉菌，为明确该菌的种类及对烟草的致病力，对所得菌株进行形态学鉴定、DNA序列分析和致病性测定。结果表明，菌株菌落呈放射状型，并逐渐变为花瓣型，菌丝无隔；孢子囊球形、梨形；藏卵器球形；雄器钟状或不规则；rDNA-ITS序列测定分析，该菌序列与GenBank

2、上登录号KC014615.1和GU133597.1等的序列同源性大于99%，鉴定为钟器腐霉(PythiumvexansdeBary)。对培育到10叶期的‘中烟100’品种接种，7天后该菌的病情指数为48，对照瓜果腐霉(P.aphanidermatum)的病情指数为62.7，表明其对‘中烟100’的致病力不及瓜果腐霉。.jyqkvexansIsolatedfromTobaccoBianChuanhong1,A、OA培养基上，25℃黑暗条件下培养，7天后观察菌落特征，在显微镜下观察并测量子实体大小。用十字交叉法测菌落直径，计算

3、日生长速度[6]。1.3分子生物学鉴定采用CTAB法[7]提取腐霉菌的基因组DNA，利用通用引物ITS1和ITS4对其核糖体DNA-ITS序列进行PCR扩增。反应体系[8]：10×PCRBuffer2.5μL，2.5mmol/LdNTP2μL，10μmol/L的引物1μL，模板DNA1μL，5U/μLTaq聚合酶0.25μL，用ddH2O将反应体系补至25μL。PCR反应程序[12]：94℃预变性5min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物在1.

4、0%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，紫外灯下检测扩增产物的有效性。检测到合适的条带后，将其所对应的原始扩增产物（未纯化）40μL寄往上海生工测序。1.4致病力测定1.4.1烟苗培育方法将营养土（江西天慧牌烟草专用育苗基质与土壤等量混合）装入育苗托盘中铺平，将筛选好的‘中烟100’种子播下，每格1~3粒，再覆盖1层营养土，喷水至足够湿润但无积水，待子叶展开后减少喷水量，在烟苗长至十字期，将其移栽到10cm×10cm的营养钵中，室内每天12h光照培育至10叶期备用[9-10]。1.4.2接种方法腐霉菌在PDA培养基上培养3~4

5、天后，用打孔器（直径7mm）在菌落边缘打取菌碟，选取健康的长势一致的烟株，用解剖针在其茎基处刺8~10伤口，把菌碟贴在伤口处，并用湿脱脂棉球保湿固定，每个处理设15个重复[11-12]。以瓜果腐霉(P.aphanidermatum)菌株作对照。1.4.3观察记载‘中烟100’接种腐霉后24h黑暗处理，24h后室内12/12光照培育，3~7天内定期观察病害发生情况，根据植株茎部和叶片症状分级[13-14]，分级标准参照Shehata[15]的报道，略作修改。0级—不发病；1级—病斑小于植株茎围1/2，叶片不萎蔫；2级—病斑小

6、于植株茎围1/2，仅接种部位附近1~2个叶片萎蔫；3级—病斑大于植株茎围1/2，萎蔫叶片数小于总叶片数的1/2；4级—病斑大于植株茎围1/2，萎蔫叶片数大于总叶片数的1/2，但顶部1~2片不萎蔫；5级—病斑环绕植株茎围，全株萎蔫。病情指数(DI)计算如式(1)[8-11]：式中：DI为病情指数；Si为病级；ni为相应病株数；i=1、2、3···；N为调查总株数。DI＝Σ(Sini)/5N×100……………………………(1)2结果与分析2.1培养性状与形态特征菌株在CMA、OA培养基上菌落呈圆型、白色、放射状，并逐渐变为花瓣

7、型，边缘整齐，气生菌丝稀薄（图1），在CMA培养基上日生长速率为22mm/d。在光学显微镜下观察菌丝直径约2.5~6.5μm，平均直径约4.1μm，菌丝无隔，非常发达且分枝繁茂；孢子囊顶生，多球形，少数梨形、袋形、卵圆形，直径约12.5~20.0μm，平均直径约16.1μm；藏卵器为球形，平滑，顶生，有时间生，直径约12.5~30.0μm，平均约18.0μm；雄器的形状有钟状、拳头状、粒状或不规则形，顶生，每一藏卵器有1~2个雄器；卵孢子球形，光滑，大多不满器，少数满器，大小约13.8~25μm，平均约18μm，壁厚约0.

8、6~2.5μm，平均约1.4μm。根据以上形态学特征，将其鉴定为腐霉属(Pythiumsp.)。2.2核糖体DNA-ITS序列分析对菌株进行rDNA-ITS序列测定，获得有效序列长度609bp，在GenBank上进行BLAST比对，使用Clustal_X(1.83)软件对自测序列以及从GenBank下载