烟草根黑腐病菌thielaviopsis basicola致病力分化与遗传多样性研究

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1、西南大学博士学位论文烟草根黑腐病菌Thielaviopsisbasicola致病力分化与遗传多样性研究姓名：窦彦霞申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：周常勇20120605摘要摘要烟草根黑腐病是世界性烟草病害，其病原菌为根串珠霉劢fP正删f删括6傩纪D7口(Berk．&Br．)Ferr．，该菌寄主范围广泛，可为害多种重要的农作物。关于该病菌形态及分子遗传多样性研究方面国内未见深入系统报道，为明确我国不同烟区烟草根黑腐病菌形态、致病力及分子遗传多样性，本论文开展了以下几方面研究：(1)对我国云南

2、、甘肃、贵州、重庆和河南5个主要产烟省(市)烟草根黑腐病样品进行病原分离，按照柯赫氏法则对得到的病原菌进行致病性测定，结合其形态特征及rDINA．ITS分子方法鉴定其所属种。(2)测定了不同菌株菌丝生长和孢子萌发的影响因子。(3)对各地代表性菌株进行致病力差异测定，并比较了7个烟草主栽品种的室内抗性水平。(4)详细观测所有菌株在V8培养基上的菌落形态和厚垣孢子特征，参照Punia&sun的培养方法和分群鉴定依据对其进行分群鉴定。(5)利用ISSR-PcR标记技术对86株来自烟草和胡萝卜的根串珠霉菌株进

3、行分子遗传多样性分析。(6)利用显微及超微技术探究病原菌的侵染机理。结果表明：1．从我国云南、甘肃、贵州、重庆和河南5省(市)不同烟区采集具有典型根黑腐症状的烟草病害样本及病根处土壤，用改进的胡萝卜圆片法分离病原菌，共得到45个野生型单孢分离菌株，柯赫氏法则证病结果显示这些菌株均为该病的致病菌，另有13株白色变异型菌株为野生型菌株室内培养时产生。形态学及rDIN“ITs分子鉴定结果均显示：所有菌株包括两株来自胡萝卜的参试菌株，在分类上均为根串珠霉觋沱fcⅣi印s妇6础fcD如(Berk．&Br．)Fe

4、rr．。病菌rDNA．ITS序列分析结果显示，白色变异型菌株与其野生型菌株序列一致，不同寄主来源根串珠霉rDNA-ITS序列有差异。2．选取菌落形态不同的菌株CPwl．1、cwH．1和HLL-1’，测定影响其菌丝生长和孢子萌发的培养因子。结果表明：在czapek培养基上HLL．1’不生长，cPwl．1和CwH．1可缓慢扩展形成稀薄疏松的菌落，供试培养基中最适合三者生长的分别为PDA、PsA和PcA。温度对供试菌株菌丝生长有明显影响。3个菌株在5℃~35℃间均能生长，最适温度均为25℃。供试菌株在pH-

5、4～12范围内均能生长，CPWl-1、CWH．1和HLL-1’分别在pH=7、pH=10和pH=6时菌丝生长速度最快，在培养基偏酸或偏碱时，CPwl．1菌落易产生白色扇状变异。除木糖外两个野生型菌株都能有效利用各种供试碳源，氮源中则是牛肉膏和酪氨酸的利用效果最好。相同光照或相同温度条件下cPwl—1孢子萌发率均高于CWH一1，在有机营养存在时，情况则相反：黑暗条件有利于孢子萌发，cPwl．1、cwH．1和HLL．1’孢子萌发的最适温度分别是20℃、15℃和20℃。3．采用伤根接种法对15个烟草根黑腐菌

6、株进行致病力差异测定，并比较了7个烟草主栽品种的室内抗性水平。研究结果表明：供试的15株烟草根黑腐病菌引致的病害程度不一，病情指数从19．2～62．5不等，致病力分化明显，其中4株表现强致病力，中等致病力菌株10株，白色变异体甩L．1’为弱致病力菌株，野生型菌株中未发现弱致病力菌株。不同烟草品种对同西南大学博士学位论文一菌株的抗性差异大，可产生高感、感病、中抗和抗病等不同抗性反应；在供试的烟草品种中，贵烟4号、秦烟96和中烟100有较强的抗病性。4．参照Punia&Sun的分群鉴定方法，将来自烟草的4

7、5个野生型和13株白色变异型共58个根黑腐菌株进行了分群鉴定。结果表明：我国烟草根黑腐病菌分离株存在明显形态变异，共划分出6个群，其中群I、II、III为野生型，群Ⅳ、V为白色变异型；另有白色变异型HLL-1’菌落平展白色，厚垣孢子簇生或单生，有瓶梗孢子产生，形态特征明显不同于其它群，将其建为新群——群Ⅵ。群I、II、III、Ⅳ、V及VI的分离频率分别占41．4％、32．8％、3．4％、19．0％、1．7％和1．7％。群庄要分布重庆和云南，群II在五个采样省(市)均有分布，群Ⅲ和群V仅分布在贵州，群Ⅳ

8、主要分布在重庆、河南和云南。群Ⅵ仅在河南有分布。5．以烟草根黑腐病菌基因组DNA为模板，采用单因素水平优化的方法对砌DNA聚合酶、M92+、dNTP和模板等的浓度，以及退火温度等几个因素进行优化，建立了根串珠霉IssR-PcR优化反应体系，利用该体系从20个ISSR引物中筛选出6个多态性较好的IssR引物，PCR扩增86个不同菌株后获得大量清晰可重复的DNA指纹图谱，其平均多态位点百分率为70．91％。供试总样本的sh锄on多样性指数J为0．5504，N