资源描述:
《flt3基因突变与il-3受体α在急性髓系白血病的表达意义》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、FLT3基因突变与IL?3受体α在急性髓系白血病的表达意义吴勇,陈景龙,骆社丹,陈元仲【摘要】目的研究FLT3基因突变与IL?3受体α(IL?3Rα)在急性髓性细胞白血病(AML)的表达及临床意义。方法采用RT?PCR及限制性片段长度多态性(RFLP)分析检测20例AML患者IL?3Rα的表达水平及FLT3/ITD与D835突变。结果20例中IL?3Rα高表达18例,FLT3/ITD突变7例,D835突变1例,总突变率44.4%,对照组未检测到FLT3/ITD突变。高表达IL?3Rα与FLT3/ITD阳性患者外周血白细胞计数高,白血病细胞
2、比例高,完全缓解率低。结论IL?3Rα高表达和FLT3基因突变均赋予急性髓系白血病细胞增殖优势,检测两者水平对于评价AML患者疗效、估计预后具有重要意义。【关键词】受体蛋白质酪氨酸激酶;串联重复序列;突变;受体,白细胞介素3;白血病,粒细胞,急性 急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)是一种涉及多基因遗传学改变的恶性血液病,其特征为细胞分化成熟受阻,未分化细胞大量增殖。目前认为白血病幼稚细胞起源于被称为白血病干细胞(leukemiastemcell,LSC)的细胞,而LSC则被认为是由相应的正常细胞发生至少两
3、次突变后形成的异常产物。FLT3基因(FMS样酪氨酸激酶3,FMS?liketyrosinekinase?3)是Ⅲ型酪氨酸激酶家族成员的原癌基因,FLT3基因突变是AML最常见的基因突变,主要包括内部串联重复突变(internaltandemduplication,ITD)和D835突变。IL?3受体是造血细胞因子受体超家族成员之一,IL?3受体α亚基(IL?3Rα,又叫CD123)是白血病干细胞的特异性标志,其蛋白表达产物CD123在LSC中高度表达,而在正常的造血干细胞中不表达或表达很低[1]。本研究旨在探讨两者与急性髓系白血病的疗效
4、和预后的关系。 1材料与方法 1.1临床资料 1.1.1标本采集和单个核细胞(MNC)的制备收集福建医科大学附属协和医院血液科2005年3月-2006年6月住院的20例急性髓系白血病患者外周血,年龄中位数35岁(32±3岁)。根据FAB形态学分型,20例患者包括急性原粒细胞白血病未分化型(M1)3例,急性原粒细胞白血病部分分化型(M2)7例,急性早幼粒细胞白血病(M3)4例,急性单核细胞白血病(M5)6例,外周血幼稚细胞均>60%,用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞(MNC),用PBS液洗涤细胞2遍,-80℃保存备用。
5、同时采集4例正常人外周血单个核细胞为对照。 1.1.2仪器与试剂Trizol试剂(美国GIBCOL公司),反转录试剂盒(OmniscriptRTkit,德国Qiagen公司),PCR试剂盒(HotStarTaqMastermixkit,德国Qiagen公司),限制性内切酶EcoRV(美国Ne、280nm吸光度值(D),要求D260/D280>1.8。用反转录试剂盒将上述样本的总RNA反转录成cDNA,逆转录反应体系20μL,包括细胞总RNA1μg,10×逆转录反应缓冲液2μL,5mmol/LdNTPs2μL,10μmol/Loli
6、godT20引物2μL,10U/μLRNA酶抑制剂1μL,4U/μL反转录酶1μL,余用无核酸酶水补至20μL。在37℃中反应60min,95℃反应5min灭活逆转录酶,-20℃保存备用。 1.3RT?PCR扩增IL?3RαmRNA的表达水平和FLT3?ITD突变PCR采用HotStarPCR试剂盒,PCR反应体系25μL:HotstarTaqMastermix12.5μL,cDNA1.5μL,10pmol/μL上、下游引物各0.2μL,余用水补至25μL。PCR反应条件:95℃预变性15min,然后进入循环(94℃变性30s→54℃或
7、61℃退火45s→72℃延伸60s)共30循环,72℃延伸10min。PCR所用的引物及PCR产物的预期片段为: IL?3Rα: 上游:5‘CTGTCTCCTGCAAACGAAGG3’ 下游:5‘GTTGACGCCTGTTGGCAACG3’ 预期片段479bp。 FLT3/ITD: 上游:5‘GGTGGTTGTCTCCTCTTCATTGTCG3’ 下游:5‘TTTGACGGCAACCTGGATTG3’ 预期片段288bp,包含近膜(JM)区和激酶结构域的起始部位,覆盖文献报道的大多数ITD所在的区域。 内参照人β?act
8、in: 上游:5‘CCTCGCCTTTGCCGATCC3’ 下游:5‘GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC3’ PCR产物的预期片段626bp。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电