鳖甲抗肝纤维化活性组分的研究论文

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1、鳖甲抗肝纤维化活性组分的研究论文唐尹萍，胡春玲，施婧妮，高建蓉，姚航平，刘焱文【摘要】目的筛选鳖甲抗肝纤维化的活性组分。方法传代培养的HSC-T6与鳖甲Bj61～Bj68共同培养72h后，采用MTT比色法测定各浓度组HSC-T6的增殖情况。结果Bj61～Bj65和Bj68对HSC-T6细胞无抑制作用，而Bj66和Bj67有较强的抑制作用。结论Bj66和Bj67为鳖甲的活性组分。【关键词】鳖甲;活性组分;MTT比色法AbstractObjectiveToscreentheactiveconstituentfromCar

2、apaxTrionycis.MethodsSecondarycultureHSC-T6invitro,pactsofTrionyxsinensisatdifferentconcentrationsonHSC-T6.ResultsBj61-Bj65andBj68hadnoinhibitoryeffectonHSC-T6cells,.freelCarapaxTrionycis.Keyann的背甲.freelpus公司产品;洁净工作台，上海博迅医疗设备厂产品。1.2试验方法1.2.1鳖甲透析物干燥粉末的制备精密称取鳖甲粉末

3、100g，加200ml双蒸水超声提取20min，抽滤，残渣加水100ml超声10min，抽滤，合并滤液，冷冻干燥得冻干粉。再用少量水将冻干粉溶解，装于透析膜内，用100ml水于4℃透析5h，透析2次，合并膜外溶液，冷冻干燥。最后得鳖甲干燥粉末为淡黄色絮状粉末，即为鳖甲的抗肝纤维化活性肽类物质5(M6000)。1.2.2鳖甲抗肝纤维化活性部位不同组分的分离称取50g葡聚糖凝胶G-25(SephadexG-25)，加入过量双蒸水，加热溶胀约2h，放置冷却至室温，装柱。取0.3653g醋鳖甲透析物干燥粉末，用双蒸馏水8ml

4、溶解，加入色谱柱上端，用蒸馏水洗脱，收集流分，每份10ml，共收集8个流分，即将鳖甲抗肝纤维化活性肽类物质分离为8个部位，分别记录为Bj1～Bj8，其中Bj4、Bj6和Bj7为活性部位6。再称取70g葡聚糖凝胶G-15(SephadexG-15)，加入过量双蒸水，加热溶胀约2h，放置冷却至室温，装柱。取0.4012gBj6样品，用双蒸馏水5ml溶解，加入色谱柱上端，用蒸馏水洗脱，收集流分，每份10ml，共收集8个流分，即将鳖甲抗肝纤维化活性部位Bj6分离为8个组分。提取分离流程见图1。图1提取分离流程1.2.3HSC

5、的培养及传代将传代的HSC-T6培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和1%NEAA的High-DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养;在倒置显微镜下观察细胞长到亚单层或细胞密度约80%～90%时，是HSC-T6传代的标志;吸弃培养基，加入0.25%胰蛋白酶1～2ml，37℃消化2～3min，待细胞回缩，瓶壁有少量细胞脱落，即用含血清培养基终止;收集细胞悬液于50ml消毒离心管中，1700r/min，4℃离心7min，弃去上清液，加入含10%胎牛血清的DME

6、M用吸管反复吹打、分散细胞，取细胞悬液光镜下计数，完全培养基调整细胞浓度，以1×105/ml传代。1.2.4MTT比色法测定HSC增殖传代HSC-T6细胞按1×105的密度接种于96孔培养板，每孔加100μl，细胞贴壁长满孔底12h后，换用5%FCS的DMEM培养基，培养12h后，分别加入高、中、低剂量Bj61～Bj68(以含5%FCS的DMEM培养基倍比稀释成16、8、4mg/ml，用0.45μm滤膜过滤)，4孔重复，另设空白对照组(含5%FCS的DMEM培养基)。培养72h后，去培养基(翻板)，每孔加20μlMT

7、T溶液。孵育4h，每孔加入DMSO100μl，在微型混合器上振荡2min，10min后于酶标仪上0D490值，再按下式计算抑制率：抑制率=(1-药物组OD值对照组OD值)×100%1.3统计学方法实验结果以x±s表示。应用单因素方差分析，P0.05表示差异有显著性。2试验结果传代培养的大鼠肝星状细胞系HSC-T6与不同浓度Bj61～Bj68样品共同培养72h后,采用MTT比色法测定各浓度HSC-T6增殖情况。与空白对照组相比，样品Bj66、Bj67在各浓度对HSC-T6细胞均有抑制作用，其中高、中浓度差异均有显著性(

8、P0.05)。结果见表1。表1鳖甲Bj61～Bj68对HSC-T6细胞增殖的抑制作用3讨论肝纤维化是慢性肝病发展至肝硬化甚至原发性肝细胞癌的必经阶段，是各种慢性肝病的共同病理学基础7。在肝纤维化形成的过程中，肝星状细胞(HSC)的“持久化”激活和增殖是中心环节8;阻抑激活的HSC增殖和诱导促进HSC凋亡是防治肝纤维化的重要措施9。在临床应用上，