shrna抑制cox2基因表达对肝癌细胞hepg2生长的影响论文

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1、shRNA抑制COX2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响论文杨义明刘预涂植光陈亚芹刘靳波【摘要】目的：应用RNA干扰技术抑制COX2基因，观察其对肝癌细胞HepG2生长的影响.方法：构建靶向抑制COX2基因表达的短发夹双链RNA(shRNA)真核表达载pshRNACOX2，转染肝癌细胞HepG2，用RTPCR和TT法检测对HepG2细胞生长的影响.结果：与未转染组相比，pshRNACOX2重组表达质粒抑制了HepG2细胞COX2mRNA及蛋白表达，抑制率分别为69.9％和50.3％；并可抑制HepG2细胞生长，

2、72h后有统计学差异(P0.05).结论：pshRNACOX2重组表达载体能显著抑制肝癌细胞COX2基因表达.freelaHepG2cells.METHODS:TheeukaryoticexpressionplasmidofshorthairpinRNA(shRNA)targetingCOX2gene(pshRNACOX2)aHepG2cells;theexpressionsofCOX2mRNAandproteinerasechainreaction(RTPCR)and109由本实验室保存.RPMI1640（Hyc

3、lone），新生小牛血清（杭州四季青公司产品），阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000(Invitrogen)，HindⅢ,BamHⅠ,RTPCR试剂（大连宝生物公司产品），COX2一抗（SantaCruz产品），COX2二抗,DAB显色试剂（北京中杉公司产品）.肝癌细胞株HepG2用含100mL/L小牛血清的RPMI1640培养基于37℃，50mL/LCO2培养箱常规培养，待细胞铺满瓶底80％左右时传代.1.2方法将合成的单链DNA片段用退火缓冲液稀释，等摩尔混合.94℃5min，缓慢降至室温形成互补双

4、链.HindⅢ，BamHⅠ双酶切质粒pGenesil1，凝胶回收大片段线性DNA，T4连接酶4℃过夜连接，转化感受态大肠杆菌JM109,铺含卡那霉素的LB抗性板培养16h，挑取菌落,增菌,.freelL，接种于六孔培养板，待细胞铺满80％左右时转染.首先用无血清无双抗RPMI1640培养基洗涤2遍.质粒4μg，加无血清无双抗RPMI1640培养基250μL，脂质体10μL，加无血清无双抗RPMI1640培养基250μL，静置5min,将二者轻轻混匀，静置20min，加六孔入培养板常规培养，4～6h换生长培养液，24h转种培养瓶.

5、G418筛选：初始终浓度800mg/L,4d左右大部分未转染细胞将被处死，维持终浓度400mg/L，2～3RNA和蛋白的检测常规胰酶消化收集细胞，冷PBS洗涤2遍，按试剂盒说明书提取细胞总RNA,逆转录成cDNA.PCR：COX2引物序列：P1：5′TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT3′,P2:5′AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT3′,扩增片段长度304bp.内参βactin引物序列：P1：5′GGGACCTGACTGACTACCTC3′P2：5′CGTCATACTCCTGCTTCCT

6、G3′，扩增片段长度543bp.PCR循环：94℃40s,55℃30s,72℃50s,38个循环.SF蛋白酶抑制剂）细胞裂解液提取总蛋白，蛋白变性上样，行100g/L十二烷基硫酸钠－聚丙烯胺凝胶电泳，转NC膜，用50g/L脱脂奶粉的TBST封闭2h,加COX2多抗（1∶200），4℃过夜，TBST洗涤3次（10min/次），二抗（1∶5000）室温2h，洗涤3次，每次10min，DAB显色.数码照相.1.2.2MTT实验检测细胞生长情况用2.5g/L胰酶将对数期生长细胞消化下来，稀释成1×108个/L，转种96孔板，每孔200

7、μL，置于37℃,50mL/LCO2培养箱培养，分别于24,48,72,96,168h时，每孔加终浓度为5g/LMTT200μL，继续培养3h，终止反应.弃去上清液，加DMSO200μL/孔，充分振荡10min，酶标仪（波长570nm）测定吸光度A值.每组3个复孔，取其平均吸光度A值，比较个组细胞生长情况.统计学分析：RTPCR和TT结果采用均数±标准差表示，组间均数比较用单因素方差分析，P0.05为有统计学意义.2结果2.1psRNACOX2重组质粒测序和转染挑取卡那霉素抗性板上生长的菌落，增菌并提取质粒，HindⅢ,Ba

8、mHⅠ双酶切切出400bp左右的DNA片断，经测序插入片断序列正确（图1）.pshRNACOX2重组质粒转染48h时，转染率为50%左右（图2）.2.2shRNACOX2重组质粒对COX2表达的影响与未转染细胞相比，pshRNACOX