肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究

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1、肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究作者：孟江萍，尹一兵，袁军，张雪梅，蓝锴，陈淑惠，王虹，涂植光【Abstract】AIM：ToconstructgalU-deletionmutantofstreptococcuspneumoniaeandgetthecapsuledeficientstrain,ococcalfunctionalgenomeresearch.METHODS:LFHPCRrcassetteologyregionstothetargetgene.Thestreptococcuspneumoniaeeddi

2、rectlyutantycinandidentifiedbyPCR.Thedeficientstrain(5×106CFU)icetodeterminethevirulence.RESULTS:GalUgenecassette.Themutanthadloice.CONCLUSION:ThegalUdeletionmutantcanbeusedtoscreeninvivopromoterinstreptococcuspneumoniaebecauseitisincapableofsynthesizingcapsularpo

3、lysaccharideandhencelosesvirulence.ThetargetgenecanbereplacedpletelybyLFHPCRproduct,sothismethodissimple,rapidandeffectiveforfunctionalgenomeresearchofstreptococcuspneumoniae.　　【Keyoniae；polysaccharides,bacterial；mutation；polymerasechainreaction　　【摘要】目的：galU基因是肺炎链

4、球菌荚膜合成的关键基因，构建该基因的缺失突变体，获得肺炎链球菌荚膜缺陷菌株，研究其生物学功能，并为肺炎链球菌功能基因组研究提供实验菌株和技术平台.方法：采用长臂同源多聚酶链式反应（LFHPCR）方法制备中间为红霉素耐药基因（erm），两侧为galU基因上、下游同源序列的连接片段，并将此片段转化入肺炎链球菌，在含红霉素的血平板上筛选出缺陷菌株.用PCR鉴定缺陷菌株，小鼠实验研究其毒力.结果：PCR结果显示galU基因完全被erm基因所替代，小鼠毒力实验表明缺陷菌株毒力显著下降.结论：galU缺失突变体在小鼠体内不能形成荚膜导

5、致其难以在小鼠体内存活，可作为筛选肺炎链球菌体内诱导启动子的宿主菌.用LFHPCR作基因突变，可完全替代靶基因，简便、快速，是肺炎链球菌功能基因组研究的一种有效的方法.　　【关键词】链球菌，肺炎；多糖类，细菌；突变；聚合酶链反应　　0引言　　肺炎链球菌（streptococcuspneumoniae,S.pn）是一种常见的条件致病菌，可引起肺炎、中耳炎、菌血症、脑膜炎等严重疾病.荚膜多糖的合成是一个多基因参与的过程，S.pn染色体上有关荚膜合成的基因位于dexB和aliA基因的之间，形成操纵子结构（capoperon），参

6、与型特异性荚膜的合成（据此可将S.pn分为90多个血清型），但是在荚膜操纵子外还存在一些基因对荚膜的合成非常重要［1］.有研究表明在所有S.pn中都存在galU基因，其编码的UDP葡萄糖焦磷酸化酶（UDPG：PP）是荚膜多糖生物合成过程中的关键酶［2］.研究证实肺炎链球菌galU基因不是细菌生存所必需的基因［3］，为可以成功构建其突变株提供了理论依据.基因缺失技术是目前研究基因功能的最佳方法，这里我们采用基于LFHPCR（longflankinghomologypolymerasechainreaction）方法失活肺炎链

7、球菌galU基因，从而获得S.pn荚膜缺陷菌株，并对该突变株进行初步的研究.　　1材料和方法　　11材料　　S.pn血清3型CMCC31203购自中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保存中心.培养基：C+Y半合成培养基，含5g/LYeast提取物（lacksandhotchkiss，1960）；TSA血平板，含50mL/L兔脱纤维全血.雌性BALB/c小鼠，体质量18~22g，购自第三军医大学动物中心.S.pnCPM8染色体DNA（含有红霉素抗性基因erm）、感受肽刺激肽（CSP），由美国MorrisonDA教授惠赠.胶回

8、收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司.PCR试剂购自上海生物工程技术服务有限公司.引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，序列如下：Primer〖〗Sequence5′3′P1〖〗GTTGAAACTGCTGGTGCTCTTAAP2〖〗TGCTTTCACTTTATTATCTTGGP3〖〗ATCAAACA