sb203580对no诱导兔关节软骨细胞nf

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1、SB203580对NO诱导兔关节软骨细胞NF作者：王红林　王治伦　陈静宏　吴劲　考希宾　高艳【摘要】　　目的探讨p38MAPK抑制剂SB203580对软骨细胞NFκB蛋白表达的影响。方法体外培养兔关节软骨细胞，经甲苯胺兰染色鉴定后，一氧化氮(NO)供体NOC18和p38MAPK抑制剂SB203580作用于细胞24h，用MTT比色法检测细胞增殖活性，TT增殖活性(P<0.05)；NOC18诱导的NFκBp65活性的升高被SB203580抑制(P<0.05)，而仅有SB203580作用于

2、细胞时，与对照组比较，差别无统计学意义(P>0.05)。结论p38MAPK促进了NO诱导的兔关节软骨细胞NFκB的表达，NO致软骨细胞凋亡的信号通路中涉及了NFκB的活性表达。【关键词】NO；SB203580；软骨细胞；NF-κB　　EffectofSB203580onNFκBexpressioninduced　bynitricoxideinrabbitarticularchondrocytes　　ABSTRACT:ObjectiveToexploretheeffectofp38MAPKin

3、hibitorSB203580onchondrocyteprotEinexpressionofNFκB.MethodsRabbitarticularchondrocytesentedMTTassaytoevaluatetheproliferationofcells,andAPK)通路在NO诱导软骨细胞凋亡中发挥了重要作用，其机制可能为：NO激活p38，继而活化核因子κB(nuclearfactorkappaB,NFκB)，再经由复杂通路最终导致软骨细胞发生凋亡[6]。另有研究报道，p38虽参与了I

4、L1引起的软骨损伤，但p38MAPK信号通路与IL1诱导的NFκB活性无关。因此，p38和NFκB是两条不同的引起软骨细胞损伤的通路[7]。本实验通过体外培养兔关节软骨细胞，研究p38MAPK抑制剂SB203580对软骨细胞活性以及NFκB蛋白表达的影响，为了解软骨细胞凋亡发生的机制和指导骨关节疾病的治疗提供依据。　　1材料与方法　　1.1材料3周龄新西兰兔1只，重约0.5kg；Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶(美国Sigma公司产品)；DME/F12细胞培养液(美国Hyclone公司)；胎

5、牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)；甲苯胺兰(美国Amresco公司)；NOC18(德国Merck公司)；SB203580(美国Promega公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)(华美生物工程公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；兔抗βactin抗体(美国LabVision公司)；兔抗NFκBp65抗体、辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(美国SantaCruz公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；ECL检测试剂盒(美国Pierce公司)。　　1.2关节软骨细胞的分离培养无

6、菌条件下分离兔关节软骨，用解剖刀将之切成约1mm3大小的碎块，分别采用透明质酸酶、胰蛋白酶和II型胶原酶分阶段消化,获得高成活率、成分均一的关节软骨细胞，接种于DME/F12培养基中，内含25%-30%的胎牛血清、105u/L青霉素、100mg/L链霉素，置入37℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养。倒置相差显微镜(Olympus)下观察细胞生长状况，隔天换液，原代细胞10d左右铺满单层，胰酶EDTA消化传代。根据实验设计，分别接种于培养瓶和24、96孔板，传代细胞7d左右融合成单层。所有实验均采

7、用第一代软骨细胞以避免去分化的问题。　　1.3甲苯胺兰鉴定待24孔板内软骨细胞贴壁爬片后，0.01mol/LPBS漂洗细胞两次，70%(体积分数)乙醇固定20min，再用PBS漂洗两次，取出细胞爬片固定在载玻片上，室温干燥。2g/L甲苯胺兰染液染色20min，迅速用无水乙醇漂洗一次，显微镜下观察并照相。　　1.4NOC18和SB203580对软骨细胞的处理第一代软骨细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察90%的细胞融合，即进行干预。所有细胞先在无血清DME/F12培养液中置入37℃、5%(体积分数)C

8、O2恒温培养箱培养24h，以减少血清对实验的干扰，然后被分为两组。第一组用终浓度分别为0(control1)、0.025、0.1、0.4、0.8mmol/L的NO供体NOC18继续作用24h；第二组按如下设计培养24h：control2[含20mL/L二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)的培养液，DMSO是SB203580的溶剂]、SB2035801μmol/L、NOC180.4mmol/L+SB2035801μm