树突状细胞融合瘤苗对大鼠骨肉瘤的主动免疫治疗论文

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1、树突状细胞融合瘤苗对大鼠骨肉瘤的主动免疫治疗论文于哲，范清宇，郝新保，龙华，刘云燕，文艳华，赵宏【关键词】骨肉瘤【Abstract】AIM:Toevaluatethetherapeuticeffectivenessoftumorvaccinefromfusionofdendriticcells(DCs)almodel.DCsobtainedfromSDratbonemarroonoclonalantibodyOX62andmagicbeads.ThentheUMR106celllineorvaccineandthetherapeuticeffectivenessofthetumorva

2、ccinetotheoriginaltumorandlungmetastasisintheanimalmodelentorvaccine,theorandtherateoflungmetastasisinthetherapeuticgrouporvaccineperhapscanbeusedintheclinicaltreatmentofosteosara.【Keymunotherapy【摘要】目的:探讨大鼠树突状细胞(dendriticcells,DCs)融合瘤苗在骨肉瘤免疫治疗中的应用.方法:用大鼠骨肉瘤细胞系UMR106建立大鼠骨肉瘤动物模型，应用重组大鼠rGMCSF,rIL4和

3、nrhTNFα培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs.freelAb免疫磁珠分离纯化后的DCs经形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定，然后将细胞系UMR106与大鼠树突状细胞融合作为瘤苗应用于荷瘤大鼠，观察其抑制肿瘤生长和肺转移的效果.结果:在治疗6bH公司)；流式细胞仪(美国BDPharMingen公司)；细胞融合仪(BTX公司的2001型)；大鼠骨肉瘤细胞系UMR106(美国AmericanTissueCultureCollection）；6～8L/L的乙醇中10min，无菌手术取出双侧股骨和胫骨，剥净肌肉组织，用PBS洗涤2遍，剪去骨两端，再洗涤2遍；用无菌注射器抽取5mL无血清RP

4、MI1640，将其针头分别从两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓直至骨变白，收入50mL离心管中，1500r/min离心收集骨髓细胞，弃上清，沉淀细胞用5mL无血清RPMI1640重悬，再经淋巴细胞分离液密度梯度离心，初步纯化单个核细胞(mononuclearcells，MNCs)，离心洗涤2次，收集沉淀的骨髓细胞.1.2.1.2DCs的培养扩增取初步纯化的MNCs，重悬于含100mL/L的小牛血清的RPMI1640培养液中，置于50mL细胞培养瓶中，加细胞因子rGMCSF(终浓度为1×106U/L)，rIL4（终浓度为0.5×106U/L）及nrhTNFα(终浓度为1×106U/L)［1-

5、3］，于37℃，50mL/LCO2条件下培养，每3日半量换液，补加细胞因子1次，于第12日收获悬浮细胞.1.2.1.3DCs的形态学检测倒置显微镜每日观察细胞生长情况及形态变化并摄片；扫描电镜观察由我校电镜中心协助完成.1.2.1.4DCs的表型检测选用FITC标记的MHCⅠ,MHCⅡ和OX62，PE标记的CD80、CD86，分别收集诱导前4,8和12d细胞悬液，调整细胞密度至5×109/L，各取50μL，加1∶20灭活正常兔血清10μL，4℃封闭10min，再分别加入上述mAb，4℃避光30min，PBS洗2次，流式细胞仪检测.1.2.1.5应用标抗大鼠OX62mAb免疫磁珠分离纯化

6、DCs用MiniMACS分离柱筛选，标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时，去除膜表面不表达OX62的细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集OX62＋细胞，具体操作按说明书进行.1.2.1.6骨肉瘤细胞的培养和融合大鼠骨肉瘤细胞系UMR106培养在含100mL/L的小牛血清的RPMI1640培养液中，呈单层生长.分别收集培养的DCs和骨肉瘤细胞，用细胞融合仪融合，操作按说明书进行.1.2.1.7融合细胞的筛选待融合细胞在培养瓶中生长24h后，用MiniMACS分离柱筛选，去除膜表面不表达OX62的细胞，即去除未融合的肿瘤细胞.1.2.1.8融合细胞的生长特性将融合细胞接种在96孔培养板中，

7、采用MTT比色法测定细胞生长曲线.1.2.1.9融合细胞的表型检测同检测DCs表型方法，流式细胞仪测定融合细胞表面MHCⅠ,MHCⅡ类抗原和OX62的表达水平.1.2.2骨肉瘤大鼠模型的制备收集培养的UMR106，洗1次，调整细胞浓度，在每只SD大鼠右后肢外侧皮下接种1×107个细胞，共60只雄性6～8enyi法检验,.freelol/L和nmol/L水平的抗原，而其他APC只能呈递mmol/L水平的抗原，体内体外，仅需少量DCs即可启动T细胞