丙酯对缺氧性血管内皮细胞凋亡的保护作用

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1、丙酯对缺氧性血管内皮细胞凋亡的保护作用【摘要】目的研究丙酯对缺氧性血管内皮细胞凋亡的影响。方法用氰化钠（Na）合并低糖DMEM培养液构建培养的人脐静脉血管内皮细胞株（ECV304）缺氧模型;四唑盐法、丫啶橙/溴乙啶荧光染色、末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记等观察细胞受损和凋亡情况。结果Na合并低糖培养液可引起血管内皮细胞凋亡。4μg/mL丙酯可显著减少由于Na引起的缺氧性内皮细胞凋亡（P<0.05）。结论丙酯对缺氧条件下的ECV304细胞具有保护作用。【关键词】内皮，血管;脱噬作用;没食子酸丙酯　血管内皮细胞具有广泛且重要的作用

2、，内皮细胞损伤是动脉硬化发生和发展的早期事件，包括坏死和凋亡［1］。内皮细胞过度凋亡是血管病变发生发展的原因之一。近年研究发现动脉硬化斑块区可检测到大量凋亡内皮细胞，而非斑块区则无［2］。抑制内皮细胞凋亡、保护内皮功能的抗氧化剂药物将可以抑制血管内皮细胞凋亡、预防血管病变的形成，并具有治疗作用［3］。丙酯是经FDA和EM及低糖DMEM培养液为Gibco公司产品;四唑盐（MTT）为Ameresco产品;PI、EB购自Sigma公司;TUNEL试剂盒为Promega公司产品。　　1.2ECV304细胞培养将ECV304细胞株用含10%胎牛血清的DMEM培养液

3、接种于六孔培养板，置于37℃、体积分数0.05的CO2培养箱中培养，细胞约3d后长满。用0.25%胰蛋白酶消化传代。　　1.3缺氧损伤凋亡模型与实验分组将培养细胞随机分成7组，待细胞生长达到80%融合时，分别加入等体积的丙酯（溶剂为含10%胎牛血清的DMEM培养液）0，0.5，1，2，4，8，10μg/mL作用24h，观察细胞的生长状况，选择适宜的药物浓度。培养细胞生长至80%融合时，随机分组，模型组加入含10mmol/LNa及10%胎牛血清的低糖DMEM培养液;丙酯组（缺氧前2h加入不同浓度丙酯预培养）;对照组用含10%胎牛血清的DMEM培养液。将

4、培养板置于CO2培养箱中，20h后取出进行检测。以60μg/mL阿司匹林作为阳性对照药。　　1.3.1四唑盐比色试验（MTT法）检测细胞活力将细胞培养在96孔培养板上，接种量为2×104，待细胞生长至80%融合时，随机分组，各组设4个复孔。培养20h后，每孔加入MTT溶液（1mg/mL）100μL，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入DMSO150μL，振荡使结晶物充分溶解后于490nm波长处测定各孔光密度（D）并记录结果。　　1.3.2丫啶橙/溴乙啶（AO/EB）荧光染色观察细胞凋亡AO、EB分别溶于pH7.2PBS中，配成100μg

5、/mL储备液，用前等量混合。取细胞悬液100μL，加入染料4μL混匀，滴于载玻片上，直接在荧光显微镜下观察。镜下可见4种细胞:活细胞核染色质被染成绿色并呈正常结构，早期凋亡细胞核染色质着绿色并呈现固缩状或圆珠状，晚期凋亡细胞膜受损，核染色质染成桔红色并呈现固缩状或圆珠状，坏死细胞膜受损，核染色质染成桔红色并呈现正常结构。　　1.3.3末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测凋亡DeadEndTMCol-orimetricTUNELSystem系统使用一个改进的TUNEL来末端标记凋亡细胞的碎片DNA。使用末端脱氧核糖核酸转移酶（T

6、dT）将生物素标记的核苷酸掺入到DNA的3'-OH末端。辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（streptavidinHRP）结合到这些生物素核苷酸上，后者可用过氧化物酶的底物过氧化氢和稳定的色素原联苯二胺（DAB）检测。凋亡细胞核苷酸被染成深棕色。各组分别计数1000个细胞，计算各组凋亡细胞数并进行比较。　　1.4统计学处理每组试验重复3次，实验数据以均值±标准差表示，统计处理应用SPSS11.0进行方差分析，配对资料t检验。　　2结果　　2.1丙酯对ECV304细胞生长的影响作用培养液中加入不同浓度的丙酯后，当浓度为1～4μg/mL时细胞生长状况良好，在

7、该浓度范围对细胞活力的影响具有剂量依赖性。<1μg/mL或>4μg/mL时，可见大量固缩、漂浮的细胞，提示细胞活力下降。本实验设定丙酯浓度为1～4μg/mL。丙酯2，4μg/mL对细胞增殖的作用强于阿司匹林（60μg/mL），丙酯1μg/mL无效（表1）。　　表1丙酯对ECV-304细胞生长的影响（略）　　与对照组比较，*:P<0.05.　　2.2丙酯对Na引起的细胞凋亡的保护作用　　2.2.14μg/mL丙酯对Na引起的内皮细胞凋亡具有显著的改善作用（表2）。　　表2丙酯对内皮细胞存活的干预作用（略）　　与模型组比较，*:

8、P<0.05.　　2.2.2AO/EB荧光染色观察可见丙酯