α 在血管内皮细胞凋亡中的作用

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1、α在血管内皮细胞凋亡中的作用　　摘要:目的探讨TNFα引起的血管内皮细胞（VEC）凋亡在皮肤撕脱伤早期血栓形成中的作用.方法分2组，实验组:内皮细胞（EC）+TNFα，拮抗组:用EC+TNFα+TNFα抗体处理.采用流式细胞仪分别测定实验组TNFα不同时间、不同浓度以及拮抗组EC凋亡率.结果EC凋亡率随TNFα作用时间增加，0～48hEC凋亡率为（2.6±0.42）%～（40.5±8.3）%;EC凋亡率也随TNFα浓度而增加，0～3000umL-1EC凋亡率分别为（2.6±0.42）%～（13.7±2.

2、6）%;TNFα抗体明显拮抗TNFα诱导的EC凋亡（P<0.01）.结论TNFα可引起EC的凋亡和死亡，具有时间依赖性和浓度依赖性，人重组TNFα单抗可消除因TNFα引起的毒性作用.　　Keyornecrosisfactor;apoptosis;skin/injuries;endothelium，vascular　　Abstract:AIMTostudytheeffectofTNFαonapoptosisofvascularendothelialcells（VEC）inearlysecondthr

3、ombosisafterskinavulsion.METHODSItentalgroup（EC+TNFα）andinhibitorygroup（rhTNFαAbpretreatmentofEC+TNFα）.Accordingtovarioustimesandconcentration，apoptosisrateofvascularendothelialcellseasuredbyFCMforexperimentalgroupandinhibitorygroup.RESULTSTNFαcausedmass

4、ivedeathofendothelialcellsinprimarycultureinaconcentration-andtime-dependentmanner.ApoptosisrateofEC0to48hand（2.6±0.42）%～（13.7±2.6）%from0to3000umL-1inexperimentalgroup，anditde-creasedsignificantlyininhibitorygroup.CONCLUSIONTNFαcausesapoptosisofECinaconc

5、entration-andtime-de-pendentmannerandrhTNFαmonoclonalantibodycande-creasecytotoxicforECcausedbyTNFα.　　0引言　　血管内皮细胞（vascularendothelialcells，VEC）是机体调节心血管系统的内分泌器官.在创伤、动脉粥样硬化等疾病中，氧自由基、炎性介质、Ca2+超负荷等因素可引起损伤EC，内皮细胞（endothelialcells，出现EC）功能障碍［1-3］.EC损伤除以“坏死”形式出现

6、外，还可发生“凋亡”，即一种细胞自主的有序性死亡.在皮肤撕脱伤撕脱皮瓣中，血液和组织TNFα明显升高［2］，VEC的坏死除直接皮肤挤压撕脱因素外，是否存在着TNFα的升高引起VEC的凋亡不得而知.我们通过探讨TNFα在VEC凋亡中的作用，了解皮肤撕脱伤早期血栓形成所致的组织坏死机制.　　1材料和方法　　1.1材料　　Ⅰ型胶原酶系Sigma产品，DMEM系Hyclone产品，TNFα和TNFα系Promega产品;内皮细胞系获自娩出30min人胎盘脐静脉.　　1.2方法　　HUVEC培养用0.5gL-1胶

7、原酶从脐静脉中消化、分离EC，含200mlL-1胎牛血清的DMEM培养，将培养的EC第2或3代以2×104个细胞/cm2接种到25mL培养瓶，直至融合［2］.分为2组，①实验组:EC+TNFα（n=3），②拮抗组:预处理的EC+TNFα+TNFα抗体（n=3）.分别测定TNFα浓度为3000umL-1条件下37℃，50mLL-1CO2培养箱孵育，时间为0，8，24及48h实验组EC的凋亡率;TNFα浓度分别为0，50，200及3000kuL-1条件下孵育时间为8h实验组EC的凋亡率;以及拮抗组8h，30

8、00kuL-1条件下EC凋亡率.人重组TNFα抗体被稀释1/100（15mgL-1），预处理的方法:EC与TNFα抗体在TNFα加入前37℃孵育1h.　　用细胞刮子将培养的EC从培养瓶中刮出（避免用胰酶消化损伤细胞膜），在室温条件下离心（500rmin-1，5min），弃上清液.向各离心管内加入结合缓冲液490μL，混匀，将EC数量配制成5×105～1×106个.先加入碘化丙啶（PI）10μL，后加入结合素V（AnnexinV）5μL进行活