家蚕30kc6蛋白抗细胞凋亡作用机制及其对血管内皮细胞保护作用的研究

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2、本研究由国家高技术研究发展计划“863"项目(No．2011AAl00603)浙江省自然基金项目(Y3090339)提

3、供资助浙江理工大学硕士学位论文家蚕30Kc6蛋白抗细胞凋亡作用机制及其对血管内皮细胞保护作用的研究摘要30K蛋白是家蚕幼虫体血淋巴中的一类低密度脂蛋白，已有的研究证明家蚕30Kc6蛋白作为30K蛋白家族的成员之一，除了具有载脂功能，还具有较强的抗昆虫细胞和哺乳动物细胞凋亡的作用，但目前30Kc6蛋白对人血管内皮细胞(Humanvascularendothelialcell，HUVEC)凋亡的影响及其作用机制还未见报道。动脉粥样硬化是一种严重威胁着人类健康的疾病，血管内皮细胞的凋亡在动脉粥样硬化形成过程中起着重要作用，内

4、皮细胞作为血管系统的屏障，是氧化型低密度脂蛋白(Oxidizedlowdensitylipoprotein，Ox．LDL)作用的靶点，研究表明Ox．LDL可导致内皮细胞氧化应激损伤，因此，干预内皮细胞的氧化应激损伤可成为防治动脉粥样硬化疾病的主要手段之一。由于30K蛋白兼具载脂功能和抗细胞凋亡的活性，我们推测其可能既具有降血脂、疏通血管的作用，又具有保护心血管细胞的结构和功能，将其作为新的心血管疾病药物研制，很可能具有重要意义。在本研究中，我们利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕细胞中大量表达、纯化了家蚕30Kc6蛋白，并对

5、该蛋白的抗家蚕BmN细胞和HUVEC细胞凋亡的作用机制进行了研究。首先，利用H202诱导的家蚕BmN细胞凋亡模型，研究了家蚕30Kc6蛋白对BmN细胞的保护作用，研究结果表明5pg／mL家蚕30Kc6蛋白能够有效地降低H202诱导引起的BmN胞内DNA的片段化程度、降低胞内8．异构前列腺素(胞内氧化应激水平标志物)的浓度，并能有效地抑制细胞色素C从线粒体中释放进入细胞质，从而发挥对细胞的保护作用。然后，我们利用HUVEC凋亡模型以及动脉粥样硬化动物模型进一步研究了30Kc6蛋白对Ox．LDL诱导的HUVEC凋亡的影响，

6、并深入探索了其抗细胞可能的作用机制和药用效果。研究结果表明1．25lag／mL30Kc6蛋白对氧化应激诱导的血管内皮细胞凋亡具有明显的保护作用；此外，8．异构前列腺素检测结果也显示家蚕30Kc6蛋白实验组的HUVEC中8．异构前列腺素的形成量明显减少，说明家蚕30Kc6可通过抑制胞内活性氧族(reactiveoxygenspecies，ROS)的产生来对抗Ox．LDL诱导的细胞凋亡。Westernblot分析结果显示Ox．LDL能够激活促进细胞凋亡的MAPkinase信号通路，而30Kc6蛋白可通过调节JNK和p38M

7、APKinase信号通路来抑制Ox．LDL诱导的HUVEC凋亡。动物实验结果也表明30Kc6蛋白对动脉粥样硬化动物模型的具有一定的预防和治疗效果。以上研究结果表明：家蚕30Kc6蛋白对H202诱导的家蚕BmN细胞凋亡和Ox．LDL诱导的HUVEC凋亡均具有明显的抑制作用；同时动物实验结果也表明家蚕30Kc6蛋白对动脉粥样硬化疾病具有一定的预防和治疗效果。本研究工作将为今后深入研究家蚕30Kc6蛋浙江理工大学硕士学位论文家蚕30Ke6蛋白抗细胞凋亡作用机制及其对血管内皮细胞保护作用的研究白的药理效果奠定了基础，并为开发新

8、型预防和治疗动脉粥样硬化疾病的生物亲和性药物提供新思路。关键词：家蚕；30Kc6；BmN；HUVEC；细胞凋亡；作用机制浙江理工大学硕士学位论文家蚕30Kc6蛋白抗细胞凋亡作用机制及其对血管内皮细胞保护作用的研究Abstract30Kapolipoproteinsareamajorgroupoflow—densitylipoproteininlarvaehemolymphofBombyxmori．Recentevidencesuggeststhat30Kc6asoneofthemembersof30Kapolipopr

9、oteins，besidesthebiologicalfunctionofcarryinglipoids，theyalsohavepreviouslyanti—apoptoticactivitiesininsectcellsandHeLacells，however,30Kc6onvascularendothelialcells(H