丹参麦冬配伍乙酸乙酯部位对血管内皮细胞huvec凋亡的保护机制研究

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1、万方数据一196一南京中医药大学学报2010年5月第26卷第3期JOJRNALOFNANJINGTCMUNIVERSITYV01．26No．3May．2010丹参麦冬配伍乙酸乙酯部位对血管内皮细胞(HU．VEC)凋亡的保护机制研究赵宏宇，郑璐玉，张旭，詹臻’(南京中医药大学基础医学院，江苏南京210046)摘要：目的探讨麦冬丹参配伍对过氧化氢(H20：)引起的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)凋亡具有的保护作用。方法取HUVEC，用过氧化氢造成凋亡模型，麦冬丹参配伍乙酸乙酯部位(MD-4)对损伤细胞进行干预，通过MT

2、T、Ho—eehst染色观察细胞凋亡，流式细胞仪测定细胞凋亡率及胞内Ca”来观察过氧化氢对HUVEC的损伤情况及丹参有效成分对细胞的影响，通过WesternBlotting法测定药物作用前后细胞内CREB表达量的变化。结果100#mol／I。H20224h对细胞有明显的损伤作用，丹参与麦冬的乙酸乙酯部位(MD-4)对损伤细胞有保护作用，并对CREB的表达有显著影响。结论麦冬丹参配伍有效部位M13-4对H：02造成的HUVEC凋亡有保护作用。关键词：丹参；麦冬；配伍；血管内皮细胞；保护作用中图号：R285．5文献标志码

3、：A文章编号：1000—5005(2010)03—0196—03临床治疗血瘀证，除了运用活血药物外，还常配伍养阴益气等方药，以祛除致瘀之斟¨。麦冬是常用滋阴中药，丹参是活血代表药物。试验通过丹参与麦冬配伍提取的乙酸乙酯有效部位(Mp4)对H：o诱导血管内皮细胞凋亡模型的影响，探讨其对凋亡的保护分子机制，迸一步开发临床治疗心脑血管疾病的新药。，1材料1．1药材川麦冬Ophiopogonjaponicus(Thumb)KerGawl，购自四川绵阳，经本校中药鉴定室鉴定属正品。丹参RadixSalviaMihiorrhiz

4、a，购自南京市医药公司，经本校中药鉴定室鉴定属正品。1．2药物提取与分离将粉碎好的丹参、麦冬各1．5kg置圆底烧瓶中，加入10倍量的水(15kg)，提取2h，滤过。滤渣再加8倍量水，提取2h，滤过，将滤液合并、浓缩，得水提浓缩液MD-1。药渣用8倍量的乙醇。提取2次，每次2h，滤过，浓缩，得醇提浓缩液M口7。将水提浓缩液MD-1用80％乙醇醇沉水提后，得沉淀MD-2。再将水溶液浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇反复萃取，得石油醚部位(Mn3)、乙酸乙酯部位(Mn4)、正丁醇部位(MD-5)以及水溶性部位(M

5、D-6)。．1．3药物制备有效部位MD-4用二甲基亚砜(DMSO)溶解后，终浓度小于0．01％。并以0．01％作为溶剂对照组。1．4主要试剂与仪器RPMl-1640培养基(GIBCO，USA)(每升含10％小牛血清、青霉素100U、链霉素100U，pH7．4)；小牛血清(兰州民海生物)；消化剂为0．25％胰蛋白酶(MERCK，USA)；过氧化氢(上海久亿化学试剂有限公司，生产批号：20070601)RIPA裂解液(碧云天，江苏海f-1)；BCA蛋白浓度试剂盒(碧云天，江苏海门)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天

6、，江苏海f-1)；一抗：CREBRabbitmAb(CellSignalingTechnology，USA)；二抗：PurifiedGoatAnti—RabbitIgG(康成，上海)；化学发光试剂盒(康成，上海)。显微镜(0LYPUS，JAPAN)培养箱(NAPC0，USA)；流式细胞仪(BD，USA)；电泳仪(BIO—RAD，USA)；高速冷冻离心机(HERMLE，Germany)；酶联免疫监测仪收稿日期：2009—10-08；修稿日期：2009—11—10基金项目：国家科技支撑计划。中医药诊疗技术及特色产品应用研

7、究”重点项目(2006BAIlll308)作者简介：赵宏宇(1976一)，女，吉林永吉人，南京中医药大学2006级博士研究生。*通信作者。13002511182万方数据赵宏字，等：丹参麦冬配伍对血管内皮细胞(HUVEC)凋亡的保护执制研究第3期(BIO—RAD，USA)；凝胶成像系统(BIO—RAD，USA)。2方法2．1人脐静脉内皮细胞鉴定及体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)株(购自南京凯基公司)接种于无菌培养瓶中，加入适量RP-M11640培养液(含10％的小牛血清、青霉素100U／mL、链霉素100U／mL

8、)，于5％C02、37℃饱和湿度的培养箱中培养。每3～5d传代1次。传代时用0．25％胰酶消化，用培养液吹打制成细胞悬液。按浓度接种传代。2．2分组实验分为5组：正常组(无任何诱导物)，对照组(以终浓度为100pmol／L的H202造模)，MD-4低、中、高剂量组(即H：0：造模后，作用24h，中药终浓度分别为1、10、100ttg／mL)。2