丹参对槟榔碱诱导血管内皮细胞凋亡影响的实验分析

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1、硕士学位论文前言刖胃口腔粘膜下纤维性变(OralSubmucousFibrosis，OSF)是一种慢性、隐匿性、具有癌变可能的疾病。其主要病理特征是在黏膜固有层和黏膜下层胶原纤维增多、玻璃样变、血管闭塞或狭窄。“⋯。目前认为OSF与咀嚼槟榔、胶原代谢紊乱、免疫、遗传、微循环及血液流变学等因素有关“⋯。其可能的发病机制有：(1)OSF组织中存在高分化能力的成纤维细胞(Fibroblast，FB)亚型“”““；(2)槟榔碱刺激FB增生及胶原合成增加““；(3)OSF组织中胶原酶活性下降致胶原降解减少“⋯：(4)某些细胞因子参与了OSF的纤维化过程，如

2、OSF组织中TGF—B、ET表达增高、肥大细胞介质刺激FB增生、胶原合成增加“”“o“”；(5)口腔黏膜角朊细胞(keratinocyte，KC)培养上清液能促进口腔黏膜FB增殖“⋯。至今为止，OSF的病因、发病机理仍不明了““，国内外学者对其病因等方面做了大量的研究，以往的研究多将FB当作主要研究对象，认为FB增殖活跃导致胶原合成堆积、胶原降解减少而引起OSF。近年来，有关角朊细胞、细胞因子在OSF发病机制中的作用有较多报道o”o”。随着对OSF研究的深入，学者们发现了OSF早期即有明显的微血管内皮细胞的损伤，OSF中VEC及平滑肌细胞ET-1

3、表达增加“”o”。血管内皮细胞(VascularEndothelialCell，VEC)作为重要的效应器官和内分泌器官，它的损伤可导致细胞活性因子如一氧化氮(NO)、内皮素(endothelin，ET)、血小板衍生生长因子(plateletderivedgrowthfactor，PDGF)、转移生长因子(transforminggrowthfactor，TGF)等分泌异常㈣。文献表明VEc受损后分泌的各种细胞介质在动脉粥样硬化、肺纤维化、硬皮病等组织纤维化中超重要作用。“。但VEC是否在OSF发生发展过程中起作用以及槟榔碱对VEC凋亡的影响目前未

4、见报道。因此，我们设想槟榔碱可能通过影响VEC并改变其分泌功能，从而导致OSF的发生和发展。细胞凋亡是由凋亡相关基因启动的细胞自主死亡的过程。天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(Cysteinylaspartate—specificproteinases，Caspases)家族是哺乳动物细胞中程序性死亡(ProgrammedCellDeath，PCD)即细胞凋亡的介导者和执行者，是细胞凋亡发生的关键分子。”。在人类细胞中，Caspases的超表达或激活均可引起细胞凋亡，因此又称死亡蛋白酶。Caspases最初表达时为无活性的蛋白酶原，由大小两亚基组

5、成乜61。无活性的Caspases酶原可通过自发激活或特异性酶促级联反应在相应位点切割而被激活。在细胞凋亡过程中，参与上游事件调节的Caspases为凋亡启动因子(initiators)，包括Caspase一8、硕士学位论文刖舌9，它们分别为死亡受体信号传导途径与线粒体信号传导途径的凋亡启动因子：而直接水解底物并导致细胞解体的是效应子(effectors)，包括Caspase一3、6、7，其中Caspase一3为执行凋亡过程中最重要的效应子。OSF的预防和治疗也一直是临床医生感到十分棘手的问题，曾用于I临床的治疗方法有：局部或全身使用激素类药物、

6、手术切除纤维条索、干扰素治疗、高压氧治疗等∞“83，但至今尚未找到一种很理想的治疗方案。丹参是一种活血化瘀药，具有扩张血管、改善微循环以及很强的抗氧化作用，已广泛用于治疗系统性硬皮病、肝硬化、心脑血管等疾病㈨。“。”。临床上用丹参注射液治疗OSF患者已取得了较好疗效“1，治疗后发现口腔粘膜微红、变软，爬行的毛细血管清晰可见。本课题组实验研究发现，丹参注射液(SalviaMiltiorrhizaeInjection，SMI)能抑制FB增殖，促进FB凋亡，减少胶原合成，促进胶原降解“⋯，但丹参治疗OSF的确切机制仍不明了，为进一步探讨丹参治疗OSF的

7、可能机制，我们设想丹参是否可通过抑制血管内皮细胞凋亡、改善微循环，从而达到治疗OSF的目的。本研究旨在已有的研究基础上，应用体外培养的人脐静脉内皮细胞(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVECs)，观察槟榔碱对VEC凋亡的作用并检测凋亡细胞的Caspase-3活性，阐述槟榔碱致OSF的可能发病机理；并同时通过观察SMI对槟榔碱诱导VEC凋亡的影响，探讨丹参治疗OSF的可能作用机制。2硕士学位论文材料与方法1．1材料第一章材料与方法1．1．1主要试剂人脐静脉内皮细胞系(ECV一304，30～50代)：由我校细

8、胞培养中心提供；细胞消化液：胰蛋白酶粉剂(Sigma公司)用D-Hank’S液配成0．25％消化液，EDTA用D-Hank’S液配成0．