山莨菪碱对脂多糖结合血管内皮细胞及诱导no合成的

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1、山莨菪碱对脂多糖结合血管内皮细胞及诱导NO合成的【关键词】山莨菪碱　　关键词:山莨菪碱;内皮，血管;脂多糖类;一氧化氮　　摘要:目的实验观察山莨菪碱对细菌脂多糖（LPS）结合血管内皮细胞膜及诱导NO生成的影响.方法体外分离培养牛主动脉血管内皮细胞，用免疫组化显色反应显示细菌脂多糖与血管内皮细胞的结合，并通过图像分析对结果进行半定量;用高压液相色谱分析细胞培养液中NO3-的含量，间接反应NO的生成水平.结果细胞分组处理，间接法显色后图像分析，结果表明山莨菪碱组的平均灰度值明显低于LPS组（P<0.05）;并且对细

2、胞培养液中NO3-的检测显示山莨菪碱组的浓度明显低于LPS组（P<0.05）.结论山莨菪碱能够抑制LPS结合血管内皮细胞，并且能够抑制LPS对NO合成的诱导作用.　　Keyine;endothelium，vascular;lipopolysac-charides;nitricoxide　　Abstract:AIMToinvestigatetheeffectofanisodamineonlipopolysaccharidesattachedtothemembraneofendotheliumandinducing

3、thereleasingofnitricoxide（NO）.METHODSThebovineaorticendothelialcells（BAEC）embraneofendothelium-munocytochemistricmeans.TheNO3-levelediuminedbyhigh-performanceliquidchromatography.RESULTSAf-terbeingtreatedineshoineineinecansignificantlyinhibittheLPSattachedtothe

4、membraneofendotheliumandinducingthereleasingofNO.　　0引言　　研究与临床实践证明大剂量的山莨菪碱对于抢救内毒素休克有效，其研究的结果表明其抗休克的作用机制主要在细胞水平上.近年对大肠杆菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）识别结合细胞膜上受体，引发各种病理生理过程的研究日渐深入.本实验旨在通过体外培养血管内皮细胞，观察山莨菪碱对LPS结合血管内皮细胞膜上受体以及诱导NO合成的影响，以此进一步揭示山莨菪碱抗内毒素休克的作用机制.　　1材料和方法　　1

5、.1材料　　①药品与试剂:Ⅰ型胶原酶;正辛胺（n-octylamine）;大肠杆菌脂多糖E.coilO11B4（lipopolysaccharides，LPS，美国Sigma公司）;RPMT-1640培养基（美国Gibco公司）;抗LPS单克隆抗体参照马越云等［1］建立的方法制备;Ⅷ因子相关抗原抗体与CD14单克隆抗体（武汉博士德生物技术公司）;辣根过氧化酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG抗体（华美生物工程公司）;盐酸消旋山莨菪碱（芜湖长江药业有限公司产品，批号9806192）.地塞米松（天津药业有限公司）;②仪器设

6、备:高压液相色谱仪（美国Beckman公司）;CMIAS系列-多功能彩色病理图像分析系统（北京航空航天大学图像中心）.　　1.2方法　　①细胞培养与鉴定:无菌条件下取牛主动脉血管10～15cm，管腔注入1gL-1Ⅰ型胶原酶，37℃消化20min，收集消化液，离心洗涤细胞2次，计数，以1×108L-1细胞数接种于含200gL-1小牛血清的1640培养液，5mLL-1CO2，37℃条件下培养，胰酶消化传代，实验用6～10代细胞.培养细胞用Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体检测呈阳性;②内皮细胞膜结合:LPS-sCD14复合物的检测

7、细胞均匀爬片，每8张一组，分4组:空白对照组，LPS组，山莨菪碱组，CD14抗体组.其中山莨菪碱组含山莨菪碱25mgL-1;CD14抗体组含抗CD14单克隆抗体3mgL-1.;除空白对照组以外，各组的培养液中均含LPS1.0mgL-1.药物在含200gL-1小牛血清的1640培养液中作用4h后，40gL-1中型甲醛固定细胞，抗LPS单克隆抗体（50mgL-1）检测结合于细胞膜上的LPS，用间接法进行免疫组化染色，由辣根过氧化物酶-DAB系统显色.在CMIAS系列-多功能彩色病理图像分析仪上进行计算机辅助图像分析;③细

8、胞培养液的处理:细胞以2×105/孔浓度均匀接种到24孔板中，贴壁生长.每20孔一组分为4组:空白对照组，LPS组，山莨菪碱组，地塞米松组.其中山莨菪碱组含山莨菪碱50mgL-1;地塞米松组含地塞米松60mgL-1;除空白对照组以外，各组的培养液中均含LPS10mgL-1.于200mLL-1小牛血清的1640培养液中培养.各组分别在实验开始4，