蛋白激酶C参与脂多糖诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达.doc

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1、蛋白激酶C参与脂多糖诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达作者：葛海燕，冯健，贲素琴，倪松石【摘要】　　目的：观察蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）在内毒素/脂多糖（lipopolysacchride，LPS)诱导血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）表达上调中可能发挥的作用。方法：以肺微血管内皮细胞为研究对象，用PKC抑制剂预处理内皮细胞，以RT-PCR检测VEGFmRNA水平的表达变化；WesternBlot检测其蛋白质水平的表达变化。结果：(1)VEGFmRNA的表

2、达水平与LPS呈剂量和时间依赖的关系；（2）PKC抑制剂calphostinc预处理内皮细胞能显著抑制LPS诱导VEGFmRNA和蛋白的表达。结论：LPS可能通过PKC信号通路而诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达上调。【关键词】脂多糖蛋白激酶C肺血管内皮细胞血管内皮细胞生长因子　　[Abstract]Objective:Toinvestigatewhetherlipopolysacchride（LPS）-inducedvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)expressionwasmediatedbypr

3、oteinkinaseC（PKC）.Methods:Theratpulmonarymicrovascularendothelialcells(RPMVECs)werechallengedwithLPSbeforePKCinhibitor(calphostinc)orvehicle,thelevelsofVEGFmRNAwereassayedbyRT-PCR,andthelevelsofVEGFproteinwereassayedbyWesternBlot.Results:LPSinducedVEGFexpressionattimeandd

4、osedependentmannerinRPMVEC.PretreatmentofthesecellswiththePKCinhibitor(calphostinc)markedlyinhibitedtheLPS-inducedVEGFexpression.Conclusion:LPSmayinduceVEGFexpressioninRPMVECmediatedinpartbyPKCsignalpathway.　　[Keywords]Lipopolysaccharide;ProteinkinaseC;Pulmonarymicrovascu

5、larendothelialcell;Vascularendothelialgrowthfactor血管内皮细胞(vascularendothelialcell,VEC)　　处在血液与血管平滑肌细胞之间,能分泌多种生理活性物质,调节血管功能，血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)即为其中之一。VEGF具有促进VEC分裂、诱发新血管形成及增加血管通透性的作用[1,2]。本文以培养的肺微血管内皮细胞为模型,以细菌脂多糖(lipopolysacchride,LPS)为诱导因素,从VEGF

6、和蛋白激酶C（proteinkinasec,PKC）着手，以阐明其发生机制。　　1材料和方法　　1.1材料LPS（Escherichiacoli,0111:B4),calphostin5C均购自Sigma公司，DMEM培养基和Trizol试剂购自GibcoBRL公司，小牛血清购自Hyclone公司，细胞培养板购自Corning公司，VEGF多克隆抗体购自SantaCruz公司，ECLWestern检测系统购自CellSignal公司；PCR逆转录试剂盒购自FermentasMBI公司。　　1.2方法　　1.2.1大鼠肺微血管内皮细胞分离培

7、养和处理大鼠肺微血管内皮细胞的分离,培养参照Chen等的方法[3]，将新生1d的SD仔鼠处死，乙醇浸泡消毒5min，取出肺组织用PBS冲洗，将肺的周边切割成1mm×1mm×1mm大小组织块，用吸管将组织块均匀放置在培养瓶内，间距约1cm。加入含10％胎牛血清、105U/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基，放入37℃、含5％CO2、湿度为95％～100％的孵箱内，静置培养60h后去除组织块。3～4d更换1次培养液。第1～2周80％～90％细胞单层汇合时，用0.5%胰蛋白酶消化后按1∶3传代。实验用2～5代细胞。相差显微镜下，细胞

8、呈典型的铺路石状排列，采用CD31抗原间接免疫荧光染色进行鉴定。实验开始前细胞无血清培养24h。实验细胞分为：(1)正常对照组和用不同浓度LPS刺激内皮细胞24h，分别测定VEGFmRNA和蛋