蛋白激酶c参与脂多糖诱导肺微血管内皮细胞vegf表达

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1、蛋白激酶C参与脂多糖诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达：葛海燕，冯健，贲素琴，倪松石【摘要】　　目的：观察蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）在内毒素/脂多糖（lipopolysacchride，LPS)诱导血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgroRNA水平的表达变化；ethods:Theratpulmonarymicrovascularendothelialcells(RPMVECs)RNAeanddosedependentmannerinRPMVEC.Pretreatmentofthes

2、ecellsarkedlyinhibitedtheLPS-inducedVEGFexpression.Conclusion:LPSmayinduceVEGFexpressioninRPMVECmediatedinpartbyPKCsignalpathonarymicrovascularendothelialcell;Vascularendothelialgroa公司，DMEM培养基和Trizol试剂购自GibcoBRL公司，小牛血清购自Hyclone公司，细胞培养板购自Corning公司，VEGF多克隆抗体购自SantaCruz

3、公司，ECLBI公司。　　1.2方法　　1.2.1大鼠肺微血管内皮细胞分离培养和处理大鼠肺微血管内皮细胞的分离,培养参照Chen等的方法[3]，将新生1d的SD仔鼠处死，乙醇浸泡消毒5min，取出肺组织用PBS冲洗，将肺的周边切割成1mm×1mm×1mm大小组织块，用吸管将组织块均匀放置在培养瓶内，间距约1cm。加入含10％胎牛血清、105U/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基，放入37℃、含5％CO2、湿度为95％～100％的孵箱内，静置培养60h后去除组织块。3～4d更换1次培养液。第1～2周80％～90％细胞单

4、层汇合时，用0.5%胰蛋白酶消化后按1∶3传代。实验用2～5代细胞。相差显微镜下，细胞呈典型的铺路石状排列，采用CD31抗原间接免疫荧光染色进行鉴定。实验开始前细胞无血清培养24h。实验细胞分为：(1)正常对照组和用不同浓度LPS刺激内皮细胞24h，分别测定VEGFmRNA和蛋白的表达；(2)正常对照组和100ng/mlLPS刺激内皮细胞6h、12h、24h、36h和48h，分别测定VEGFmRNA和蛋白的表达；(3)正常对照组和用终浓度分别为0.01~1μmol/L的calphostinc预处理内皮细胞30min后，用LPS刺

5、激内皮细胞24h，分别测定VEGFmRNA和蛋白的表达。　　1.2.2RT-PCR应用TrizolReagent从各组内皮细胞中提取总RNA。以Oligo(dT)为引物,遵循RNA逆转录试剂盒操作步骤合成dscDNA。根据VEGF(Genebank:AF062644)基因序列,用primerpremier软件设计的PCR反应体系中的上下游引物,分别为：　　上游引物为:5'-CACATAGGAGAGATGAGCTTC-3′　　下游引物为:5'-TCGTCACCGTCGACAGAACAG-3′　　扩增产物400bp,GAPDH上下游

6、引物分别为：　　上游引物为:5'-GAAACTACCTTCAACTCCATC-3'　　下游引物为:5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'　　扩增产物250bp，以逆转录反应的产物dscDNA为模板进行扩增，反应参数为:94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25循环，最后于72℃继续保温5min，反应产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。反应结束后,取PCR反应液(10μl)进行琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪上观察结果。　　1.2.3WesternBlot细胞培养至相应的时间后弃去培养液提取蛋白并用改良L

7、owry法进行蛋白定量，从相应蛋白样品中取等量的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离的蛋白质转印至PVDF膜后，在5%脱脂奶粉封闭液中室温封闭1h。随后以抗VEGF(1∶1000稀释)孵育过夜。1×PBST洗涤3次后加入相应的二抗孵育2h。洗涤后以ECL检测，通过X胶片感光而获得蛋白信号。β-actin作为内参。　　2.1.2LPS诱导内皮细胞VEGF表达的时间依赖性　　100ng/mlLPS刺激内皮细胞后，VEGFmRNA表达相对量逐渐升高，LPS24h处理组VEGFmRNA表达量达到峰值（图2A）；LPS刺激36h后VEG

8、FmRNA表达相对值开始下降。VEGF蛋白质表达变化与mRNA表达变化相一致，LPS上调VEGF蛋白表达呈时间依赖关系（图2B）。　　2.2PKC参与LPS诱导内皮细胞VEGF的表达用0.01~1μmol/LcalphostinC预处理内皮细胞，其以剂量依赖的方