山莨菪碱对脂多糖结合血管内皮细胞及诱导no合成的抑制作用论文

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1、山莨菪碱对脂多糖结合血管内皮细胞及诱导NO合成的抑制作用论文.freeline;endothelium.freelineonlipopolysaccharidesattachedtothemembraneofendotheliumandinducingthereleasingofnitricoxide（NO）.METHODSThebovineaorticendothelialcells（BAEC）embraneofendothelium-munocytochemistricmeans.TheNO3

2、-levelediuminedbyhigh-performanceliquidchromatography.RESULTSAf-terbeingtreatedineshoineineinecansignificantlyinhibittheLPSattachedtothemembraneofendotheliumandinducingthereleasingofNO.0引言研究与临床实践证明大剂量的山莨菪碱对于抢救内毒素休克有效，其研究的结果表明其抗休克的作用机制主要在细胞水平上.近年对大肠杆菌脂

3、多糖（lipopolysaccharides，LPS）识别结合细胞膜上受体，引发各种病理生理过程的研究日渐深入.本实验旨在通过体外培养血管内皮细胞，观察山莨菪碱对LPS结合血管内皮细胞膜上受体以及诱导NO合成的影响，以此进一步揭示山莨菪碱抗内毒素休克的作用机制.1材料和方法1.1材料①药品与试剂:Ⅰ型胶原酶;正辛胺（n-octylamine）;大肠杆菌脂多糖E.coilO11B4（lipopolysaccharides，LPS，美国Sigma公司）;RPMT-1640培养基（美国Gibco公司）;

4、抗LPS单克隆抗体参照马越云等［1］建立的方法制备;Ⅷ因子相关抗原抗体与CD14单克隆抗体（武汉博士德生物技术公司）;辣根过氧化酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG抗体（华美生物工程公司）;盐酸消旋山莨菪碱（芜湖长江药业有限公司产品，批号9806192）.地塞米松（天津药业有限公司）;②仪器设备:高压液相色谱仪（美国Beckman公司）;CMIAS系列-多功能彩色病理图像分析系统（北京航空航天大学图像中心）.1.2方法①细胞培养与鉴定:无菌条件下取牛主动脉血管10～15cm，管腔注入1gL-1Ⅰ型胶

5、原酶，37℃消化20min，收集消化液，离心洗涤细胞2次，计数，以1×108L-1细胞数接种于含200gL-1小牛血清的1640培养液，5mLL-1CO2，37℃条件下培养，胰酶消化传代，实验用6～10代细胞.培养细胞用Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体检测呈阳性;②内皮细胞膜结合:LPS-sCD14复合物的检测细胞均匀爬片，每8张一组，分4组:空白对照组，LPS组，山莨菪碱组，CD14抗体组.其中山莨菪碱组含山莨菪碱25mgL-1;CD14抗体组含抗CD14单克隆抗体3mgL-1.;除空白对照组以外，各组

6、的培养液中均含LPS1.0mgL-1.药物在含200gL-1小牛血清的1640培养液中作用4h后，40gL-1中型甲醛固定细胞，抗LPS单克隆抗体（50mgL-1）检测结合于细胞膜上的LPS，用间接法进行免疫组化染色，由辣根过氧化物酶-DAB系统显色.在CMIAS系列-多功能彩色病理图像分析仪上进行计算机辅助图像分析;③细胞培养液的处理:细胞以2×105/孔浓度均匀接种到24孔板中，贴壁生长.每20孔一组分为4组:空白对照组，LPS组，山莨菪碱组，地塞米松组.其中山莨菪碱组含山莨菪碱50mgL-1

7、;地塞米松组含地塞米松60mgL-1;除空白对照组以外，各组的培养液中均含LPS10mgL-1.于200mLL-1小牛血清的1640培养液中培养.各组分别在实验开始4，8，16，32h时各取5孔培养液，每孔1mL.经三氯乙酸除蛋白并过滤后于-20℃保存待测;④细胞培养液NO3-浓度的检测:参照Rizzo等［2］的高压液相检测方法，选取250mm×4.6mmC18柱为色谱柱，以10nmolL-1n-octy-lamine为流动相（2nmolL-1H2SO4调pH值至6.0±0.2），检测波长220n

8、m.流动速度1mLmin-1.统计处理:数据以x±s表示，两组实验数据分别做t检验与多因素方差分析（ANOVA）.2结果2.1山莨菪碱对LPS结合血管内皮细胞的影响在CMIAS系列-多功能彩色病理图象分析仪上，200倍视野下，每张片子分别随机观察记录1个视野，记录所测细胞的平均灰度值.灰度单位分为256个等级，LPS与血管内皮细胞的结合量与灰度值呈反比关系（Fig1（略））.2.2山莨菪碱对LPS诱导血管内皮细胞NO合成的影响NO的半衰期极短，很快被氧化为NO2-/NO3-，并且N