海洋小单孢菌来源的轻快菌素b fw5233的体外抗肿瘤活性

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1、海洋小单孢菌来源的轻快菌素BFW5233的体外抗肿瘤活性【摘要】目的考察轻快菌素BFTT比色分析法、流式细胞法和高内涵药物筛选的方法检测FethodsTheinhibitoryeffectsoftheFTTassay,floetryandhighcontentscreeningmethods.ResultsFarineMicromonospora微生物次级代谢产物是新药的重要来源。海洋微生物具有独特的代谢方式，产生的次级代谢物化学结构具有明显的复杂性和多样性，有的是陆地微生物所不具备的。海洋微生物药物的研究开发工作始于20世

2、纪70年代，在90年代得到很大的发展。迄今已从海洋微生物的代谢产物中分离出几百种生物活性物质，其中有些是可能有临床应用价值的抗肿瘤抗生素，如海洋放线菌产生的新型抗肿瘤抗生素lomaiviticins［1］和salinosporamideA［2］已进入临床研究阶段。因此从海洋微生物中筛选到新型抗肿瘤抗生素的成功率相对较大。从海洋小单孢菌筛选新抗肿瘤生物活性物质过程中，我们发现了海洋小单孢菌Micromonosporasp.FIM02523产生有抗肿瘤活性的脂肽类化合物FTT比色分析法测定各孔在570nm的光吸收值A570，计算

3、不同浓度的Fl，加入Fl，36h时终止培养。分别收集细胞，PBS洗两次(1000r/min，5min)，细胞重悬于1ml冷75%乙醇中固定过夜，加等量的PBS洗两次(1000r/min，5min)，加胰RNA酶(10mg/ml，Sigma产品)100μl，置37℃15min。加碘化丙啶(PI)溶液(PI50μg/ml，柠檬酸钠0.1%，TritonX1000.1%)500μl，4℃30min，用流式细胞仪(BeckmanCoulterEpicsXLCytometer)检测并分析结果。(3)对小鼠成纤维细胞L929细胞凋亡的影

4、响L929细胞以3000个/孔的密度接种到胶原蛋白包被的96孔板上，37℃，5%CO2培养箱培养24h，加入不同浓度的Fics公司多指标细胞凋亡试剂盒进行测定，按试剂盒操作程序分别加入线粒体、细胞核荧光染色剂和细胞骨架纤维状肌动蛋白Factin的荧光染色剂，使用该公司的高内涵药物筛选系统(ArrayScanHCS)采集数据并进行分析［4］。2结果2.1对肿瘤细胞凋亡及细胞周期的影响Fl)。K562肿瘤细胞培养液加入Fl，培养36h时用流式细胞仪分析细胞凋亡和细胞周期。药物处理组可见明显的凋亡峰，随药物浓度增大，凋亡细胞的比例

5、增加。药物处理后的K562肿瘤细胞阻滞在G0/G1期，S期细胞比率下降(Tab.1)。G0/G1期的阻滞使细胞进入S期减少，抑制肿瘤细胞的增殖。2.2对肿瘤细胞核、骨架蛋白、线粒体膜电位的影响应用Cellomics公司多指标细胞凋亡试剂盒测定，并以紫衫醇为对照药物，应用该公司的ArrayScanHCS系统采集数据。Fl(紫衫醇IC50500ng/ml)，表明Fl的Fl以上使L929肿瘤细胞细胞核明显增大，FActin含量增加，线粒体膜电位明显增加(Fig.1～Fig.3)。以上结果说明Fl。FW5233能抑制肿瘤细胞L92

6、9的生长，使L929细胞核缩小、细胞骨架纤维状肌动蛋白Factin含量、线粒体数量及膜电位均减少。FW5233抑制肿瘤细胞L929生长的作用机制与紫衫醇不同，特别是它能抑制肿瘤细胞微丝的合成并降低线粒体膜电位。抗肿瘤药物的筛选靶位很多，作用于细胞骨架微丝是其中一个靶位。微丝在多种肿瘤细胞中被大量修饰，并伴随着微丝相关调节蛋白的改变，与肿瘤细胞异常的生长特点如黏附及转移有关［5，6］。以微丝及其相关调节蛋白为靶点的抗肿瘤药物对肿瘤细胞有较高的选择性，目前作用于微丝的药物仅发现了不到10种，如来源于真菌的细胞松弛素(cytoc

7、halasin)阻止肌动蛋白聚合成微丝，具有抗肿瘤的潜能。生物碱鬼笔环肽(phalloidin)同细胞松弛素的作用相反，只与聚合的微丝结合，而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后，抑制了微丝的解体，因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡，也具有抗肿瘤作用［7～9］。Lantrunculins是一类来自海洋生物的抗肿瘤药物，可与多种肿瘤细胞的微丝结合，并使之解聚，抑制肿瘤细胞增殖［10］。2005年又报道了来源于海绵的bistheonellideA和phenochalasinB是新的破坏微丝的药物［11］。这些作用于微丝

8、的药物都是国外发现的，国内未进行这方面的药物筛选。我们实验首次报道海洋小单胞菌产生的轻快菌素BFicromonosporalomaivitiensis［J］.JAmChemSoc,2001,123(22):5362～5363.［2］FelingRH,BuchananGO,Mi