复方玉泉丸保护dna损伤有效部位研究

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1、复方玉泉丸保护DNA损伤有效部位研究作者：吴凤琪，陈茂勇，李磊，柳艳吴倩，张良【摘要】　　目的探讨复方玉泉丸保护DNA损伤活性部位及作用机制。方法用不同极性的提取剂热回流序贯提取复方玉泉丸有效成分。在二苯代苦味酰肼自由基（DPPH）和·OH自由基模型上探讨各提取物清除能力，并用CuSO4-Phen-VitC-H2O2-DNA化学发光体系测定DNA损伤保护作用。结果各提取部位均能使DPPH自由基体系在517nm处吸光度明显降低，且在30min内持续下降。浓度为0.625mg/ml时，70％乙醇提取物对DPPH

2、的清除率为93.6％，比同浓度下甲醇、丙酮提取物清除能力分别高48.1％和159.3％。无DNA发光反应体系中，乙醇提取物浓度达0.333，0.5，1mg/ml时，其发光强度分别降低33.8％，54.3％和74.5％。有DNA存在时，70%乙醇、丙酮和甲醇提取部位在浓度为0.625mg/ml时，对DNA损伤抑制率分别为84.3％，31.5％和51.5％，受损时间分别延长17.4，2.3min和12.1min。结论70%乙醇提取物能有效降低DNA损伤程度，并使DNA氧化损伤延迟，其机制与清除DPPH及·OH自

3、由基活性有关。【关键词】复方玉泉丸DNA损伤有效部位化学发光糖尿病是一种常见的多病因、有遗传倾向的内分泌代谢紊乱性疾病，其发病率正在逐年增长。经典的糖尿病并发症的多元醇途径、糖基化终末产物途径、蛋白激酶C途径和氨基己糖途径，均是高糖环境下，线粒体呼吸链中氧自由基生成过多导致的结果［1］。由于自由基具有很高的反应活性，它将在分子、细胞乃至器官水平给机体造成损伤，诱导多种并发症［2～5］。因此，在糖尿病、尤其是并发症防治中，重视体内自由基的清除和阻止自由基引起的损伤具有十分重要的意义。玉泉丸是我国治疗糖尿病的中

4、药验方，具有生津止渴、清热除烦、养阴滋肾、益气和中之功能，特别是在糖尿病并发症防治方面疗效确切［6～9］。但是，长期以来，对玉泉丸的研究和开发较少，其降血糖作用及具有防治糖尿病并发症的物质基础不清、标准不严、剂型单一。本研究针对糖尿病并发症的危害，以清除DPPH自由基活性及防止·OH自由基引起的DNA损伤为指标，初步筛选玉泉丸药效作用的有效部位，为糖尿病并发症的防治和玉泉丸新剂型的开发提供参考。　　1器材　　1.1仪器德国OrionⅡ微孔板发光检测仪；DU600紫外-可见分光光度计；北京长风8002型电热恒

5、温水箱；LDZ5-2低速自动平衡离心机；RE-52AA旋转蒸发仪。1.2材料二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)、抗坏血酸(AsA)、小牛胸腺DNA和邻-菲罗啉(Phen)购自Sigma公司；二丁基羟基甲苯(BHT)购自上海凌峰化学试剂有限公司(化学纯)。硫酸铜、过氧化氢、醋酸、乙醇、甲醇、石油醚、乙醚、丙酮、盐酸均为国产分析纯。复方玉泉丸原料由南京大中华药店购买。　　2方法　　2.1玉泉丸制备与提取　　2.1.1复方玉泉丸的制备取麦冬(60g)、五味子(30g)、生地黄(60g)、葛粉(150g)、天花粉(1

6、50g)和甘草(25g)粉，按中药部颁标准（l提取液，热回流(温度根据提取液沸点不同而定)提取30min，过滤。将滤液在沸水浴中蒸干，称重。滤渣用另一种较高极性的提取液序列提取，如此反复，得不同部位提取物。用乙醇溶解定容至一定浓度作为待测液。所用提取液顺序为：石油醚、乙醚、70%乙醇、丙酮、甲醇和水。另称取两个10g玉泉丸粉末分别用70%乙醇和人工胃液（pH1.2盐酸水溶液）单独提取。　　2.2DPPH自由基清除活性称取5.9mgDPPH自由基，用乙醇溶解后定容到25ml，此为储备液。应用前稀释10倍，使其

7、浓度为6×10-5mol/L。向1ml的6×10-5mol/LDPPH溶液中加入0.1ml试样(空白用等量无水乙醇代替)，总体积为1.1ml。摇匀后，测定DPPH混合液在517nm处的吸光度（OD）值，每2分钟测定1次，持续测定30min。用1ml乙醇与0.1ml试样提取液调仪器零点，以扣除试样本身颜色的影响。取其第30min时的吸光度计算其清除率：清除率(%)=［(A0-A样)/A0］×100%其中A样、A0分别为DPPH与样品和无水乙醇在30min时的吸光度。由于DPPH在光照下吸光度会下降，操作中应注

8、意避光，保证每次DPPH反应液的吸光度基本一致。　　2.3·OH自由基清除及DNA损伤保护在1ml离心管中加入230μl醋酸缓冲液(pH=5.5)、100μl待测液(空白用100μl缓冲液代替)，30μl硫酸铜(50000μmol/L)、200μlVitC(28000μmol/L)、100μlPhen(35000μmol/L)、140μl浓度为750μmol/LDNA(空白用240μl缓冲液代替)，最后加入200