大鼠羊膜上皮细胞神经营养因子基因的表达论文

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1、大鼠羊膜上皮细胞神经营养因子基因的表达论文董智勇李忱陈东孟晓婷李玉林【摘要】目的建立胚胎不同时期羊膜上皮细胞（AECs）表达脑源性神经营养因子（BDNF）与神经营养素3（NT3）mRNA的时相图，找出AECs分泌BDNF、NT3的最佳时期。方法采用实时荧光定量PCR检测胚胎不同时期（11，13，17，21d）AECs中BDNF与NT3mRNA的表达差异。结果绘制出大鼠AECs中BDNF、NT3的基因表达差异时程图：BDNF的表达随着胚胎发育持续上调，至17d达到最高，然后其表达开始下调；NT3的表达在13d达到最高，然后开始下调。结论初步确定13～17d是大鼠AECs分泌

2、BDNF、NT3的最佳时期。【关键词】羊膜上皮细胞；脑源性神经营养因子；神经营养素3；实时荧光定量PCR【Abstract】ObjectiveToinvestigatethedifferencesofBDNFandNT3geneexpressionoftheamnionepithelialcells(AECs)frompregnancyratsandestablishthephasediagramofgeneexpressiontofindthebesttimeofBDNFandNT3secretion.MethodsThedifferencesofBDNFandNT3ge

3、neexpressionoftheamnionepithelialcells(AECs)fromdifferentphaseofpregnancyrats(E11,13,17and21days)ePCR.ResultsBDNFmRNAbryonicdevelopment,reachedthepeakonE17d,andthenRNAreachedthepeakonE13d,andtheneofBDNFandNT3secretionofAECsarefromE13dtoE17d.【Keynioticepithelialcells;Brainderivedneurotrophicfac

4、tor;Neurotrophin3;RealtimePCR羊膜上皮细胞（AECs）是羊膜的主要细胞成分.freelRNA、蛋白质的表达；RAECs（E1516d）的条件培养基可以促进神经干细胞（NSCs）的存活与神经分化〔3〕。因此，RAECs可以作为细胞模型代替HAECs研究AECs在胚胎发育过程中的作用。本研究应用RTPCR建立胚胎不同时期AECs表达BDNF、NT3mRNA的时相图，找出AECs分泌BDNF、NT3的最佳时期，为AECs应用于临床奠定实验基础。1材料与方法1.1材料Trizol试剂购自北京博奥生物公司；引物合成由北京博奥生物公司完成；RTPCR仪（R

5、oche公司LightCyclePTC225）；LightcyclerfaststartDNAmasterSYBRgreenⅠ（购自Roche公司）；孕期11～21dV1.5μl，DEPC水3μl，终体积20μl。42℃90min。-20℃保存备用。1.5RTPCR使用Roche公司LightCyclerPCR仪，试剂为LightcyclerfaststartDNAmasterSYBRgreenⅠ。NT3引物：上游5′CTCAGCCATTGACATTCGG3′，下游5′AGTGCTCGGACGTAGGTTT3′。BDNF引物：上游5′CAGTATTAGCGAGTGGGTCA3

6、′，下游5′GATTGGGTAGTTCGGCATT3′。GAP引物：上游5′TGCTGAGTATGTCGTGGAG3′，下游5′GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT3′。实验体系：镁离子浓度3mmol/L，引物浓度0.4μmol/L，退火温度60℃，95℃预变性10min；95℃10s，60℃5s，72℃15s，78℃测定荧光强度，重复40个循环；75℃至95℃绘制溶解曲线。PCR产物2μl在1.5％琼脂糖凝胶电泳。1.6数据分析绘制时程规律图。2结果以归一化后的基因表达量差异为最终结果，根据孕期大鼠11、13、17、21d羊膜上皮表达BDNF、NT3的基因表达差异绘制时程图，

7、结果显示：BDNF的表达持续上调，至17d达到最高，然后其表达开始下调；NT3的表达在13d达到最高，然后开始下调。见表1。表1E11E21BDNF、NT3归一化后的基因表达量差异（略）3讨论AECs是羊膜的主要细胞成分，在神经发生早期，羊膜直接与神经上皮联系，在神经发育及向羊水中释放类似神经递质与NTFs的过程中扮演着重要角色。大量实验表明AECs是细胞移植治疗中枢神经系统疾病的理想细胞：首先AECs与神经组织具有一定的相似性与同源性，能与神经组织