大鼠羊膜上皮细胞神经营养因子基因的表达

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1、大鼠羊膜上皮细胞神经营养因子基因的表达作者：董智勇李忱陈东孟晓婷李玉林【摘要】目的建立胚胎不同时期羊膜上皮细胞（AECs）表达脑源性神经营养因子（BDNF）与神经营养素3（NT3）mRNA的时相图，找出AECs分泌BDNF、NT3的最佳时期。方法采用实时荧光定量PCR检测胚胎不同时期（11，13，17，21d）AECs中BDNF与NT3mRNA的表达差异。结果绘制出大鼠AECs中BDNF、NT3的基因表达差异时程图：BDNF的表达随着胚胎发育持续上调，至17d达到最高，然后其表达开始下调；NT3的表

2、达在13d达到最高，然后开始下调。结论初步确定13～17d是大鼠AECs分泌BDNF、NT3的最佳时期。【关键词】羊膜上皮细胞；脑源性神经营养因子；神经营养素3；实时荧光定量PCR　　【Abstract】ObjectiveToinvestigatethedifferencesofBDNFandNT3geneexpressionoftheamnionepithelialcells(AECs)frompregnancyratsandestablishthephasediagramofgeneexpressio

3、ntofindthebesttimeofBDNFandNT3secretion.MethodsThedifferencesofBDNFandNT3geneexpressionoftheamnionepithelialcells(AECs)fromdifferentphaseofpregnancyrats(E11,13,17and21days)weredetectedbyrealtimePCR.8ResultsBDNFmRNAwasupregulatedandlastedwithembryonicdevel

4、opment,reachedthepeakonE17d,andthenwasdownregulated.NT3mRNAreachedthepeakonE13d,andthenwasdownregulated.ConclusionsThebesttimeofBDNFandNT3secretionofAECsarefromE13dtoE17d.　　【Keywords】Amnioticepithelialcells;Brainderivedneurotrophicfactor;Neurotrophin3;R

5、ealtimePCR　　羊膜上皮细胞（AECs）是羊膜的主要细胞成分，实验证明人AECs（HAECs）可合成释放神经营养素3（NT3）与脑源性神经营养因子（BDNF）等多种营养因子〔1〕，移植到帕金森（PD）鼠纹状体的HAECs能够存活并分泌BDNF、NT3，使PD模型鼠的行为学症状在细胞移植后2个月内得到改善〔2〕。同时本课题组应用实时荧光定量PCR（RTPCR）、Western印迹证明大鼠AECs（RAECs）中也有BDNF、NT3mRNA、蛋白质的表达；RAECs（E1516d）的条件培养基可以

6、促进神经干细胞（NSCs）的存活与神经分化〔3〕。因此，RAECs可以作为细胞模型代替HAECs研究AECs在胚胎发育过程中的作用。本研究应用RTPCR建立胚胎不同时期AECs表达BDNF、NT3mRNA的时相图，找出AECs分泌BDNF、NT3的最佳时期，为AECs应用于临床奠定实验基础。8　　1材料与方法　　1.1材料Trizol试剂购自北京博奥生物公司；引物合成由北京博奥生物公司完成；RTPCR仪（Roche公司LightCyclePTC225）；LightcyclerfaststartDNA

7、masterSYBRgreenⅠ（购自Roche公司）；孕期11～21dWistar大鼠，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供。　　1.2总RNA提取取胚胎不同时期（11、13、17、21d）新鲜羊膜上皮组织，应用Trizol法提取组织总RNA。取100μg羊膜上皮组织于冰上剪成1mm3小块，加入1mlTrizol液，反复吹打，离心；用吸管取上清放入1.5ml离心管中，室温放置10min；加入200ml氯仿混匀，室温放置3min，4℃离心15min(12000r/min)；吸上清至另一离心管中，加异丙醇500

8、ml，室温放置10min。离心沉淀，弃上清，沉淀用70%的冷乙醇洗1次，倒置管，自然干燥；每管加20μl1‰DEPC水溶解RNA，取10μlRNA作逆转录，其余-70℃冻存备用。　　1.3RNA质量鉴定用紫外分光光度计测定RNA纯度及含量，A260与A280比值在1.8～2.0之间，基本无蛋白质污染。RNA经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳后，28与18S条带清晰集中，比值大于2，表明RNA样品