大鼠羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的构建及其对受损视神经的作用

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1、第二军医大学硕士学位论文大鼠羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的构建及其对受损视神经的作用姓名：齐爱青申请学位级别：硕士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：许家军201205大鼠羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的构建及其对受损视神经的作用大鼠羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的构建及其对受损视神经的作用摘要目的：许多眼科疾病和外伤，如青光眼、视神经缺血、顿拌伤、视神经管骨折等，都可以使视网膜节细胞(retinalganglioncells，RGCs)不可逆性凋亡，最终导致视觉功能障碍。目前对于此类疾患仍无有效的治疗方法。视神经和视网膜作为中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)在颅

2、外的延伸，在动物手术位置上具有优越性，因而视神经损伤模型又常被用来模拟CNS的损伤。因此，本研究从组织工程的角度，构建大鼠羊膜上皮细胞(amnioticepithelialcells，AECs)与胶原海绵复合体，将其移入大鼠视神经损伤模型中，探讨其对损伤视神经及CNS的作用。方法：1)取妊娠晚期的SD大鼠，用胰蛋白酶序贯消化法获得原代AECs，用免疫细胞化学方法检测AECs是否表达CKl9、CoXl0及Nestin，用PlⅢ26标记第3代AECs。2)构建AECs与胶原海绵复合体，在荧光显微镜下观察复合体内AECs的存活。3)将SD大鼠随机分为4组：正常组、单纯损伤组、空支架组和复合

3、体组。单纯损伤组：在左眼视乳头后约2mm处用1mm注射器针头切开视神经外膜，完全吸除长约0。5mm的视神经，保持神经外膜的丰要血管不受损伤；空支架组：在视神经的吸断处移植相应大小的胶原海绵；复合体组：在视神经的吸断处注入10gl密度为1X107个／ml的细胞悬液后，移植相应大小的复合体。4)观察胶原海绵和复合体与视神经的组织相容性。术后第7天计数复合体内的AECs并检测其Nestin的表达。术后第28天，观察AECs与再牛轴突的关系。5)检测复合体移植对RGCs的作用：HE染色、尼氏染色、CTB—FITC顺行示踪和免疫组织化学法检测MAP一2在视网膜中的表达。6)检测复合体移植对视神

4、经的作用：HE染色、CTB．FITC顺行示踪和免疫组织化学法检测GFAP、GAP．43在视神经中的表达。7)用PanoramaMaker5软件拼接图片，用PhotoshopCS3软件计数和洲量长度，用ImageProPlus6．0软件测量面积，用SPSS18．0软件进行统计分析。结果：第二军医大学硕士学位论文1)体外培养的AECs可以表达CKl9、COXl0和Nestin，AECs具有干细胞特性和向神经类细胞分化的潜能。2)复合体内的AECs牛物活性好，细胞密度为604．3个／mm2，48％的AECs表达Nestin，复合体内部分细胞仍具有向神经类细胞分化的潜能。3)术后第28天至第

5、56天，视神经内基本不见胶原海绵的空间物理结构，胶原海绵和复合体与视神经的组织相容性好。术后7天复合体内存活的AECs密度为424．7个／mm2，17％的AECs表达Nestin。复合体内的AECs至少到第28天还有存活，并可向损伤区两侧迁移。复合体内的AECs与再生轴突伴行。复合体内AECs存活率较高，部分AECs具有向神经类细胞分化的潜能，复合体利于改善视神经再牛的微环境。4)视网膜的尼氏染色显示：术后第28天，空支架组节细胞层细胞直径≥12gm的细胞数量和细胞总数多于单纯损伤组，复合体组又多于空支架组；细胞直径<12gm的细胞数量，空支架组和复合体组多于单纯损伤组。复合体可增加

6、视网膜内各类细胞的数量，特别是大细胞；胶原海绵的作用相对较小。5)视网膜的HE染色显示：术后第28天和第56天，各实验组的节细胞层细胞数、内网层厚度和内核层厚度均比正常组少。节细胞层细胞数，术后第28天复合体组多于单纯损伤组和空支架组，术后第56天复合体组多于空支架组；内网层厚度和内核层厚度，术后第56天复合体组和空支架组均高于单纯损伤组。复合体比胶原海绵对节细胞层细胞数、内网层和内核层的增加作用更明显。6)CTB．FITC示踪的RGCs胞体及其视网膜内轴突显示：术后第28天和第56天，各实验组视网膜中央、中间和外周的CTB．FITC阳性区域面积比例均低于正常组。中央：术后第28天复

7、合体组最高，空支架组次之，单纯损伤组最低；术后第56天复合体组和空支架组均高于单纯损伤组。中间：术后第28天各实验组无明显差异，术后第56天复合体组高于空支架组和单纯损伤组。外周：术后第28天各实验组无明显差异；术后第56天复合体组高于单纯损伤组。复合体和胶原海绵可增加视网膜内存活的RGCs及其轴突，前者效果更为显著。7)CTB．FITC示踪的视神经显示：术后第28天和第56天，近侧段和损伤区的CTB．FITC阳性区域面积比例，复合体组最高，空支架组次之，