大鼠中脑导水管周围灰质内gaba与阿片μ受体共存能神经元的观察论文

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1、大鼠中脑导水管周围灰质内GABA与阿片μ受体共存能神经元的观察论文.freelu;periaqueductalgray;microscopy，confocal;immunohis-tochemistry;ratsAbstract:AIMToobserveinobutyricacid（GABA）andμopioidreceptor（MOR）co-existinneuronsoftheperiaqueductalgray（PAG）intherat.METHODSIm-munofluorescenthistochemicaldouble-stainingtechniqueicroscop

2、e.RESULTSGABA-immunoreactive（GABA-IR）neuronsainlyseeninthemedialandven-trolateralsubregionsatthemiddleandcaudallevelsofthePAG.MostofthesparselydistributedGABA-IRneuronsall-sizedandthenumberofmedium-sizedGABA-IRneuronsall.ScatteredMOR-IRneuronsainlyobservedintheventrolateralsubregionatthemiddle

3、andcau-dallevelsofthePAG.MostoftheMOR-IRneuronsall-andmedium-sized.Small-andmedium-sizedneuronssimultaneouslyshoiddleandcau-dallevelsofthePAG.CONCLUSIONThereareGABAandMORco-existingneuronsinthePAG.Thepresentresultssuggestthatendogenousopioid-likesubstancesmightregu-lateGABAergicneuronsinthePAG

4、.0引言以往的研究证明，中脑导水管周围灰质（PAG）内5-羟色胺（5-HT）能下行投射系统在调控伤害性信息向中枢的传入过程中发挥着重要作用，而γ-氨基丁酸（GABA）对5-HT能神经元具有抑制性调控作用［1-4］.有人曾报道激活中枢神经系统内的阿片μ受体（μopioidreceptor，MOR）具有直接调节GABA能神经元活动的作用［5］.激活MOR后调节GABA能神经元活动的结果能使PAG的下行投射神经元摆脱GABA能神经元的抑制（disinhibition，脱抑制）并发挥镇痛作用［6］.但PAG内的GABA能抑制性神经元是否呈MOR阳性，尚缺乏直接的形态学证据.本研究用免疫荧光

5、组织化学双重染色技术，在激光扫描共聚焦显微镜下对PAG内GABA与MOR共存的神经元进行了观察.1材料和方法1.1材料成年雄性SD大鼠8只（第四军医大学实验动物中心提供），体质量200～250g.戊巴比妥钠（4gL-1）经腹腔深麻下开胸，经左心室插管至升主动脉，先以150mL的9gL-1生理盐水冲洗，再用含40gL-1多聚甲醛和2gL-1苦味酸的0.1molL-1磷酸缓冲液（PB，pH7.4）500mL灌注固定，灌注完毕立即取脑，置于上述新鲜固定液后固定4～6h，再移入含300gL-1蔗糖的PB中至组织块沉底（4℃）.将中脑用恒冷箱作连续冠状切片，片厚15μm，切片隔2取1，分3组

6、收集.用0.01molL-1的PBS（pH7.4）充分清洗切片.1.2方法按ABC方法对第1组切片进行免疫组织化学染色，具体步骤如下:①入兔抗GABA血清（1∶1000;Chemicon）与豚鼠抗MOR血清（1∶1000;Ding等［7］）混合液，室温孵育18～24h;②入Biotin标记的驴抗兔IgG（1∶250;Jackson），室温孵育3h;③入FITC标记的Avidin（1∶3000;Vec-tor）和TexasRed标记的驴抗兔IgG（1∶200;Jack-son），室温孵育3h.上述抗体和复合物的稀释均用含3gL-1的TritonX-100和5gL-1正常马血清的PBS

7、，各步骤之间均用PBS彻底清洗切片.裱片，避光干燥，甘油与PBS（1∶1）混合液封片，激光扫描共聚焦显微镜观察并摄片.用正常兔血清和正常豚鼠血清的混合液代替兔抗GABA血清和豚鼠抗MOR血清孵育第2组切片，其余染色方法同第1组切片，进行替代对照实验，结果为阴性.将第3组切片用于Nissl染色，以便对照观察和定位免疫组织化学染色的阳性结果.2结果本研究按Beitz的方法将PAG划分为吻、中和尾三段，各段均划分为内侧区、背侧区、背外侧区和腹外侧区，内侧区包绕在导水管周围［