大豆胰蛋白酶抑制剂抑制肺癌pg细胞生长及诱导细胞调亡的研究论文

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1、大豆胰蛋白酶抑制剂抑制肺癌PG细胞生长及诱导细胞调亡的研究论文刘同祥，张少娟，艾浩，李健【摘要】目的研究大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)在体外对人肺癌PG细胞生长抑制作用和对细胞周期的影响。方法采用MTT法检测SBTI对人肺癌PG细胞的增殖抑制作用；流式细胞仪检测SBTI对人肺癌PG细胞周期的影响；电子显微镜观察SBTI对细胞调亡的作用。结果SBTI对人肺癌PG细胞的生长有明显抑制作用；SBTI可以将人肺癌PG细胞阻滞于S期；SBTI可以促使人肺癌PG细胞出现明显的染色质浓缩和凋亡小体，诱导人肺癌PG细胞的凋亡。结论大豆胰蛋白酶抑制剂能抑制人肺癌PG细胞生长、诱导人肺癌PG细胞调亡的作

2、用，其作用的机制为阻滞人肺癌PG细胞于S期，促使人肺癌PG细胞出现明显的染色质浓缩和凋亡小体，实验为大豆胰蛋白酶抑制剂抗肿瘤效应提供了实验依据。【关键词】大豆胰蛋白酶抑制剂；人肺癌PG细胞；生长抑制；细胞周期大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybeantrypsininhibitor.freela公司产品。1.2试剂与仪器DMEM培养液（InvitrogenCorporation），胎牛血清（Sigma公司），胰酶（Gibio公司），塞唑蓝(MTT，北京拜尔迪生物科技有限公司)，FIT-AnnexinV/PI凋亡试剂盒（Biovision公司）。CO2培养箱（德国Binder公司），BDS20

3、0倒置显微镜（重庆奥特仪器有限公司），XI81倒置荧光显微镜（日本，奥林巴斯公司）激光共聚焦扫描显微镜，电镜（日本奥林巴斯公司），BDFacscalibur流式细胞仪（美国BD公司）。2方法2.1细胞生长抑制实验肿瘤细胞培养。人肺癌PG细胞使用含有10%热灭活胎牛血清(fetalcalfserum，FCS)的RPMI1640全培养液，置37℃，5%CO2的培养箱培养，隔天换液，细胞可贴壁生长,.freell细胞的培养液100μl，在37℃,5%CO2的培养箱中预培养24h，加各浓度的SBTI，使终浓度分别为0，0.5，1.0，2.5，5.0mg/L，每个浓度均设6个复孔，以加有药液和

4、培养液，不加细胞的为空白对照，以含同一细胞密度的培养液为细胞对照组，分别培养24，36，48h后，每孔加入20μlMTT(5mg/ml)，37℃继续孵育4h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μlDMSO，振荡10min，以空白组调零，应用酶标仪于492nm处测定各浓度组、细胞对照组吸收度(A)值，计算细胞死亡率，求取半数抑制浓度(IC50)。求每次测定的6孔的平均值，实验重复3次。抑制率以下列公式计算。抑制率(%)=（1-样品孔A/对照孔A）×100%IC50统计方法:采用最小二乘法求回归方程，根据回归方程求IC50。2.2细胞周期的观察取不同浓度SBTI（0，0.5

5、，1.0，2.5，5.0，10.0mg/L）分别作用于对数生长期肺癌PG细胞48h后，收集贴壁及已悬浮的细胞，1200r/min离心10min，PBS洗1次，70%冰乙醇-20℃固定18h，PBS洗2次，DNAREAGENDKIT进行染色，用流式细胞仪检测肿瘤细胞周期变化，得出细胞群体在细胞G0/G1、S、G2/M期的分布比例。2.3细胞形态学观察透射电镜观察：取对数生长期细胞与不同浓度的SBTI共同培养24，48h，消化，2000r/min离心5min收集细胞，细胞沉淀用2.5%戊二醛进行前固定，锇酸后固定，并按常规方法逐级脱水、EPON812包埋、超薄切片、枸橼酸铅和醋酸双氧铀双

6、重染色，电子显微镜下观察细胞超微结构变化。2.4统计学处理所有实验数据用±s表示，用SPSS11.0进行统计分析，组间差异采用两样本均数比较的t检验。3结果3.1SBTI对肺癌PG细胞生长的抑制作用SBTI对肺癌PG细胞的生长具有明显的抑制作用。时间延长、药物浓度增加，抑制作用增强。同一浓度药物作用时间越长，细胞的生长抑制率越高，同一作用时间，药物浓度高的细胞生长抑制率相对高于药物浓度低的细胞生长抑制率，但差别无显著性。肺癌PG细胞经SBTI1.0mg/L作用24h，细胞生长抑制率为（61.39±3.92）%，作用48h后，细胞生长抑制率为（74.03±4.68）%，SBTI作用时间

7、延长，对肺癌PG细胞生长抑制的半数抑制浓度明显下降，其中24h的IC50为1.84mg/L，36h的IC50为1.34mg/L，48h的IC50为1.20mg/L。结果见图1。3.2SBTI对肺癌PG细胞生长周期的影响0.5mg/LSBTI作用肺癌PG细胞48h后，S期细胞比例为33.00%，与对照组比较无明显差异，1.0mg/LSBTI作用肺癌PG细胞48h后，S期细胞比例为36.18%，2.5mg/LSBTI作用肺癌PG细胞48h后，S期细胞比例为38