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1、异亚丙基莽草酸抗炎作用机制研究论文.freelicacid(ISA)ontranscriptionfactorSTAT1,STAT3andNF-κBinhumancervixcancerHelacell.MethodsThecellproliferationinedbytheDual-LuciferaseReporterAssaySystem.ResultsISAcannotinhibitedthegromation,ayberelatedicacid；NF-κB；anti-inflammation；Helacell异亚丙基莽草
2、酸(3,4-oxo-isopropylidene-shikimicacid,.freelega产品。高效真核转染试剂盒为威格拉斯仪器有限公司产品。1.2细胞培养将人宫颈癌Hela细胞以含10%胎牛血清的DMEM在37℃、5%CO2孵箱中培养,取对数生长期的细胞进行实验。1.3细胞增殖抑制实验取对数生长期的Hela细胞接种于96孔培养板(细胞数为2×104/孔,100μL/孔),加入不同浓度的ISA7,使其终浓度分别为0、0.1、1、10、100μmol/L,37℃、5%CO2孵箱中培养48h后每孔加入MTT溶液15μL,继续培养
3、4h后每孔加入裂解终止液100μL,37℃、5%CO2孵箱中培养1h,酶联检测仪570nm波长处测定吸收度A值。1.4质粒转染人宫颈癌Hela细胞以1×104/孔接种于96孔培养板,24h后根据高效真核转染试剂盒说明书进行转染。将报告基因质粒GAS-luc、STAT3-luc、NF-κB-luc分别和内参质粒pRL-TK共转染入上述细胞培养孔中,三复孔,重复3次。1.5双荧光素酶活性测定6h后加入0.1、1、10、100μmol/L浓度的ISA,37℃、5%CO2孵箱中培养24h后,分别加入不同的刺激剂(对STATs筛选通路用1
4、00ng/mLIFN-γ或100U/mL的IL-6刺激,NF-κB通路用1ng/μLTNF-α刺激),于37℃孵箱中继续培养6h后,收集细胞,加入1×PLB裂解液处理细胞后,用双荧光素酶试剂盒测定荧光素酶活性。1.6统计学方法定量数据以x±s表示,采用SPSS10.0软件进行统计分析。2结果2.1异亚丙基莽草酸对Hela细胞增殖的影响ISA0.1～100μmol/L不同剂量作用48h对Hela细胞体外增殖没有明显的抑制作用(见表1)。表1ISA对Hela细胞增殖的抑制作用(略)2.2异亚丙基莽草酸对Hela细胞STAT1、STA
5、T3、NF-κB荧光素酶活性的影响不同浓度的ISA处理24h后,通过双荧光素酶报告系统检测发现,与对照组比较,处理组GAS-luc、STAT3-luc活性无明显改变,而NF-κB-luc荧光素酶活性受到抑制,其中0.1～10μmol/L的ISA在TNF-α刺激状态下抑制作用更明显(见图1～图3)。3讨论ISA是木兰科植物八角茴香中提取的有效成分莽草酸的活性衍生物之一。目前实验证明,ISA有一定的抗炎作用,其抗炎作用与抑制PGE2合成即脂质过氧化有关；对局灶性脑缺血再灌注损伤具有明显的抑制作用,可明显降低脑组织匀浆MPO活性以及I
6、L-1、TNF-α的水平1-2,但其内在机制尚不清楚。本实验在以往报道基础上,以人宫颈癌Hela细胞为模型,采用MTT法,结果发现,ISA0.1～100μmol/L不同浓度作用48h对Hela细胞体外增殖没有明显的抑制作用,初步推断对细胞生长、增殖和凋亡没有明显的作用。转录因子STAT1、STAT3和NF-κB在炎症发生发展过程中起着重要的调控作用3-4。转录因子STAT1和STAT3属于STAT(signaltransducersandactivatorsoftranscription)转录因子家族成员,通常以无活性形式存在于
7、胞浆中。它们在多种炎性细胞因子、生长因子等信号转导过程中被激活,参与细胞分化、增殖、凋亡和炎症反应等生理病理过程5-6。其中,GAS-luc荧光素酶报告基因用于监测所有STAT蛋白活化,启动子区包括2个重复的GAS(gamma-interferonactivationsite)元件,源序列来自STAT1/3的靶基因ICAM-1启动子8,是所有STAT蛋白识别共同序列,它可被所有STAT蛋白识别。STAT3-luc荧光素酶报告基因用于特异性监测STAT3蛋白活性变化,基本不被其它STAT蛋白识别。在感染和炎症条件下,炎症性细胞因子
8、IL-6、IFN-γ等外界刺激经一系列JAK-STAT信号通路磷酸化STAT1和STAT3,形成STAT1和STAT3同源或异源二聚体,从而增强其DNA结合活性,激活转录活性,上调生长分化、增殖、凋亡和炎症反应等相关基因。NF-κB是一种核转录因子,其信号传导途
