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《热带假丝酵母转化烷烃过程中p450酶活的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、41卷 1期2001年2月微生物学报ActaMicrobiologicaSinicaVol.41FebruaryNo.1 20013热带假丝酵母转化烷烃过程中P450酶活的研究焦 鹏 华玉涛 李书良 黄英明 曹竹安(清华大学化工系生物化工研究所 北京 100084)关键词:热带假丝酵母,烷烃,长链二元酸,细胞色素P450酶,CO差光谱中图分类号:Q939.1 文献标识码:A 文章编号:000126209(2001)0120117204α2、ω2长链二元酸(α2、ω2LongChainDicarboxylicAcid,DCA
2、)是一种重要的化工原料,是合成工程塑料、香料、耐寒性增塑剂、涂料和液晶等物质的主要原料。目前,人们主要通过热带假丝酵母(Candidatropicalis)代谢烷烃来生产从DCA11到DCA18等不同碳链长的二元酸[1,2]。多年来在各种微生物,尤其是假丝酵母的烷烃氧化途径方面有大量的研究[3,4]。在假丝酵母转化烷烃生成长链二元酸的代谢过程中[5～7],烷烃被吸引进入细胞后,首先经过细胞色素P450酶(Cy2tochromeP450)氧化生成α2一元醇,再进一步被氧化生成α2一元酸,引过程称为α2氧化。接着α,2一元酸经过同
3、样的酶系催化,经过ω2氧化途径被氧化生成目标产物α2、ω2二元酸。在烷烃的α2、ω2氧化过程中,其中的细胞色素P450酶是关键酶,所以,在研究假丝酵母细胞代谢烷烃的过程中,对于P450酶活的研究是十分重要的。从目前国内有关长链二元酸的研究来看,其重点主要还是在于生产长链二元酸菌株的诱变筛选以及发酵工艺的改造,还没有深入到烷烃代谢途径中酶学的研究。我们在参考了国外有关细胞色素P450酶研究的基础上[8～10],逐步建立了研究P450酶的方法,这对进一步深入研究和提高二元酸的产率有重要的作用。1 材料和方法111 菌株热带假丝酵母
4、(Candidatropicalis),来源于清华大学化工系生物化工研究所。112 培养基种子培养基:NaH2PO4,012g/L;K2HPO4,014g/L;NaCl,110g/L;(NH4)2SO4,510g/L;蔗糖,20g/L;酵母膏1g/L;玉米浆1g/L;烷烃50mL/L;pH615。发酵培养基:NaH2PO4,012g/L;K2HPO4,014g/L;NaCl,110g/L;(NH4)2SO4,510g/L;蔗糖,20g/L;酵母膏1g/L;玉米浆1g/L;烷烃50mL/L;pH615;进入产酸期后,补加烷烃至1
5、00mL/L,并将pH提高到715。113 方法11311 细胞中细胞色素P450酶活力检测方法[10～12]:将待测细胞离心收集后,用TE缓冲液(pH712,Tris50mmol/L,EDTA1mmol/L)洗涤细胞,离心,收集细胞。称取50mg的湿菌体,加入1mL的溶液A(1%Tween20,40%甘油,5mmol/LDithiothreitol,1mmol/LEDTA,用pH712磷酸缓冲液定容),混匀;加入011mLKCN溶液KCN011mol/L,Tris50mmol/L,EDTA1mmol/L,pH712),混匀,
6、于冰浴中放置3国家“九五”科技攻关项目(962C03204202);国家自然科学基金重点项目(20036010);国家自然科学基金项目(30000003,29976022);中国博士后科学基金项目,中国石油化工总公司基础研究重点项目(x598022)作者简介:焦 鹏(19722),男(满族),内蒙古人,博士,清华大学博士后,目前从事代谢工程研究。收稿日期:2000201228,修回日期:2000205212118微 生 物 学 报41卷 15min。将细胞悬液分成2份(分开前混匀),其中一个用CO气体鼓泡5min,然后
7、用CO差光谱法测量。所用仪器为ShimadzuUV3000扫描仪,波长范围为400～500nm。扫描结果中,细胞悬液在波长450nm的吸光率即代表细胞中P450酶的活性[9～12]。11312 不同浓度的烷烃对P450酶的诱导作用:从平板上挑取单菌落接种于种子培养基的基液(不含烷烃)中,培养36h后,吸取5mL菌液加入含100mL种子培养液(分别加入0%、2%、4%、5%和8%的烷烃)的三角瓶,经过36h的培养后,测定细胞的P450酶活。同时测定不同烷烃浓度培养液中的菌干重。11313 发酵过程中细胞P450酶活的变化:在发酵
8、过程中,在生长阶段每6h取样测细胞酶活力;进入产酸期后,每4h测定细胞酶活力;同时测量二元酸的产量和细胞干重。2 结果和讨论211 烷烃对P450酶的诱导作用早在80年代,我国就有文献报道[6]在种子培养基中加入烷烃可以提高二元酸的产酸量,但是当时并没有给出其生物学机理,只是
