日本血吸虫重组sjtsp2-sj29kda表膜蛋白疫苗免疫效应的研究

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1、日本血吸虫重组SjTsp2/Sj29kDa表膜蛋白疫苗免疫效应的研究1前言　　　血吸虫病是由血吸虫引起的一种慢性寄生虫病。据世界卫生组织(4SF）广泛表达于多种组织、细胞，它属于小分子量的糖蛋白，大约有20多个成员[12]。Tran等通过信号序列捕获技术发现了两个TSP家族成员—SmTsp1和SmTsp2，经免疫定位实验得出，TSP表达于血吸虫体被，研究人员将假定的耐受者和感染者的血清进行ELISA检测，得知耐受者的血清中抗TSP-2的抗体IgG1和IgG3水平，在动物实验中得出SmTSP2融合蛋白免疫小鼠后，取得了减虫率57%、肝脏减卵率64%和粪减卵率

2、69%的结果[13]。因此，TSP2蛋白被认为是潜在的保护性抗原。Yuan等研究人员扩增了一段SjTSP2膜外大环区，亚克隆至pET32a质粒中表达了Trx-TSP2融合蛋白，也得出56%的减虫率、53%的肝脏减卵率和52%的粪减卵率结果[14]。　　　为了筛选出更好地疫苗候选抗原分子，探讨不同疫苗形式对免疫效果的影响。本研究选取日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团蛋白（SjTsp2）与Sj29kDa表膜蛋白胞外区（Sj29），通过基因SOEingPCR技术，用疏水性多肽（Gly4）3作为连接肽将二者进行连接，构建的融合基因pet32a/SjTsp2/Sj29

3、kDa表达质粒[6]，在此基础上，本课题通过诱导表达，大量制备重组表膜蛋白，研究其对小鼠抗血吸虫病的保护性免疫效果。血吸虫病是危害非常严重的一种人兽共患寄生虫病。近年来,在我国南方12个省的449个血吸虫流行县中,仍有90个县的疫情尚未得到控制，将近50万人转化为慢性血吸虫病人[15]。人类对人体血吸虫均无先天性免疫，宿主感染血吸虫后对再感染可产生不同程度的抵抗力，对再次入侵的童虫具有一定的杀伤作用，但对原发感染的成虫是不起作用的。现今用于血吸虫病治疗的药物效果较好的仅有吡喹酮，然而吡喹酮的作用机理是直接杀血吸虫，对于日本血吸虫虫卵各期的发育却没有明显的影

4、响[16]。因此，有效的血吸虫病疫苗的研究是目前有效防治血吸虫病重要举措之一。　　　血吸虫是一种多细胞生物，且生活史比较复杂，不同的发育阶段处于不同的环境条件下，因此它的生理、生化和相应的组织结构也随虫期的变化而不停地调整，不同虫期的新陈代谢产物也都随之变化，其中有些代谢产物在不同的虫期中普遍存在，但有些代谢产物具有种、株甚至虫期的特异性[17]。这也决定了血吸虫病疫苗研究的难度。日本血吸虫疫苗研究已有80多年的历史，大体经历了死疫苗、减毒活疫苗、分子疫苗和DNA疫苗这几个研究阶段[18]。随着近年来，有许多学者在血吸虫分子疫苗领域做了大量的研究，并取得了

5、一些成果。为了更好的提高疫苗的效果，研究人员采取了很多创新手段，构建重组多价疫苗是其中的一种方法。单一基因重组的DNA疫苗激发宿主免疫的不完全性等因素影响，单价DNA疫苗的保护效果仍不尽人意。与单一的疫苗相比，重组多价疫苗一般能获得较好的免疫效果，从而达到增强宿主抗血吸虫感染抑制血吸虫病病程进展的效果[19]。王素娟等[20]应用PCR技术构建重组抗原rSj06868，获得31.63%的减虫率和55.63%的肝脏减卵率；刘秉春等[21]用日本血吸虫DNA疫苗VR1012-SjGST-32与重组蛋白疫苗rSjGST-32联合免疫小鼠，获得42.3%的减虫率。

6、郭凡吉等[22]利用生物信息学技术筛选SjPGAM和SjEnol畜II类、鼠源（H2-d）II细胞结合表位且与宿主同源性较小的肽段，并进行拼接，经表达后免疫小鼠，获得了39.7%的减虫率和64.9%的肝脏减卵率；朱路[23]运用RT-PCR和重组PCR技术构建三价DNA疫苗pVIVO2/SjFABP/Sj26.SjGAPDH，在小鼠抗血吸虫感染中诱发减虫率和减卵率为58.6%和59.8%。以上血吸虫分子疫苗的研究中运用不同的方法构建了各种重组抗原，均得到了一定的免疫保护效果。对于血吸虫自身来说，它本身有着特殊的结构特征。血吸虫体被直接暴露于宿主血液及免疫系

7、统下，参与虫体的营养代谢、排泄、免疫逃逸和调节、渗透调节、感觉和信号转导，成为疫苗研发的热点之一[6]。血吸虫虫体的表面抗原和排泄-分泌抗原可直接接触或致敏宿主的免疫细胞，因此虫体的表面抗原尝试免疫效应攻击的把抗原，而排泄-分泌抗原常具有酶的性质，进入血液成为循环抗原，可诱发宿主的保护性免疫，或形成抗原抗体复合物，引起免疫病理变化[17]。已经有研究发现了一部分存在于体被表面的蛋白以及通过体被转运的蛋白。主要包括两种蛋白：胞内蛋白和膜结合蛋白，后者位于血吸虫体被表面[24-25]。近些年有学者通过免疫学技术等筛选出血吸虫虫体的表膜蛋白，如：Mr23000膜

8、蛋白、Mr29000膜蛋白、Mr20000膜蛋白、Mr7392膜蛋