日本血吸虫膜蛋白sjtsp2研究

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1、摘要目本血吸虫瘸烂我国一种危害严重豹人畜共患寄生虫瘸。由于中问宿主钉螺难以消灭，治疗药物吡喹嗣不能解决重复感染难题，而且有可能诱导产生抗药性，因此有必要研制高效、安全的抗盘吸虫瘸疫莹和新治疗药物。东方田蔽(Microtusfortis)是迄今为止在习本血吸虫瘸疫区发现的唯一一种感染m吸虫后不致病的哺乳动物，具有天然完全抗日本血吸虫病特性。作者曾利用重复攻击感染日本戚吸虫尾蚴的东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫成虫aDNA表达文库获得一个与曼氏血吸虫四跨膜蛋自SmTSP2基因同源性较高的EST痔弼。SmTSP2在小鼠受氏盎吸虫病模型中诱导了较高的保护效果。本文开展了日

2、本血吸虫四跨膜蛋白SjTSP2研究。I．利用获得的EST序列稳RT-PCR技术威功扩增获褥基本血吸虫SjTSP2基因(GenBank登录号EF553319)，该基因ORF禽776个碱熬对，编码215个氮基酸。生物信息学分析表明，SjTSP2基因推导氨基酸序列的N端含有信号肽，并有4个跨膜区和2个膜外睡，符合测跨膜蛋白家族的主要特征。该蛋自第二个膜外区(删2)其有多个功能位点，与CD63闻源，并存4个保守的半脘氨酸。抗原性分析表明SjTSP2蛋白EM2具有较强的抗原性。在此基础上，成功构建了含SjTSP2基因第二个貘岁}区的愿核表达痿粒SjTSP2脒2／pET28

3、b和SjTSP2EM2／pGEX一4T-2，通过抗化实验条件在EcoijRosetta(DE3)中成功表达未降解可溶的融合蛋白SjTSP2EM2／HIs和SjTSP2EM2／GST，分子量分别为15KD和36KD，Westernblotting分析表明融合蛋白具有较好的抗原性。2．璐蓿家基因a—tubulin为内参，应用荧光定量PCR技术分析了SjTSP2基因在蟊本血叛虫7d、14d和23d童虫及32d成虫体内差异表达情况。结果显示相对于每百万个n—tubulin转录拷贝，g本血吸虫7d、14d和23d童虫及32d戒虫豹转录数分剐为18776、22999、187

4、84、6195个拷贝，表明目本血吸虫SjTSP2基因在童虫中表达较高，在成虫中表达较低。应用免疫荧光技术进行组织定位分析，结果表明在血吸虫10壁虫和44天成虫的体表均可见强烈的荧光信号，在虫体内部和湾化道肠管中均未见明显的荧光信号。结果表明SjTSP2蛋自主要表达在盘吸虫体被。3．大量表达纯化rSjTSP2EM2／GST和rSjTSP2EM2／HIS熏组蛋白，并免疫昆明系小鼠进行了二批免疫保护试验。缝果与空白对照组相比，重组蛋南rSjTSP2EM2／GST在昆明系小鼠中分别诱导了25．78％和21．90％的减虫率，34．54％和42．67％的肝组织减卵率。重组蛋

5、粕rSjTSP2EM2／HIS诱导的减虫率为22．30％，差异不显著，但该蛋白诱导了较高的肝缎织减卵率。达41．99％，差异极思著。耀重组蛋鑫rSjTSP2EM2／GST和强属因跨貘蛋自豹另～血吸虫蛋白sj23酶重组蛋白LHD—Sj23／GST联合免疫组小鼠后，诱导的免疫保护效果比单个重组蛋白均商较大提高，取得了37．43％的减虫率和45．27％的肝组织减卵率，积象白对照缀比差异均极显著。鹿用ELISA方法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平变化，结果rSjTSP2重组蛋白免疫组小鼠在3次免疫麝均产生了离水平的特异性IgG抗体，推测rSjTSP2诱导的保护作用可能

6、与免疫鼠血清中高滴度的特异性IgG抗体相关。本论文蔷次壳隆了蠢本盘趿蛊四跨膜蛋白SjTSP2基因，通过生物傣患学分辑，详细预溅了该覆白的结构和功能。通过优化实验条件成功表达了未降解的可溶的SjTSP2重组蛋白。分析了SjTSP2基因在日本血吸虫不同发育时间的表达和观察了SjTSP2蛋自的组织定位。初步研究了SjTSP2重组融合蛋白的免疫保护效果并进行了机理探讨。本文较系统圭瞧开展了日本血吸虫网跨膜蛋白SjTSP2研究，对筛选血吸虫病疫苗新候选抗原分子具有重要意义。关键运：日本盘吸盎，廷跨膜缀自，克隆表达，维织定位，免疫保护AbstractSchistosomia

7、sisjaponicumcausedbyinfectionwithschistosome，isthemostharmfulparasiticzoonosisinchina．Thecurrentcontroleffortsrelyprimarilyonsnailkillingandpraziquantelchemotherapy．However,itisdifficulttoeliminatesnails(intermediatehost)completelyandpraziquantel，thesolewide—spreadefficientdrugforsch

8、istosomasis，