尿素酶基因在枸橼酸杆菌中的表达

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1、尿素酶基因在枸橼酸杆菌中的表达【摘要】目的:研究尿素酶基因在枸橼酸杆菌中的表达情况。方法：通过PCR检测枸橼酸杆菌中是否存在尿素酶基因，而后运用尿素酶诊断试剂对其是否表达进行分析。结果：39株实验枸橼酸杆菌的尿素酶基因均为阳性，只有5株菌株尿素酶表达为阳性。结论：尿素酶基因阳性的枸橼酸杆菌不一定都能表达尿素酶。【关键词】枸橼酸杆菌聚合酶链式反应尿素酶AbstractObjective:TodetecttheexpressionofureasegenesinCitrobacter.Methods:UsingPCRtoa

2、nalyzeureasegenes,andthenusingureasediagnosingreagenttodiscovertheexpressionofureasegenes.Results:thirty-ninecitrobactershaveureasegenes，butonlyfivehaveureaseexpressionpositiveresult.Conclusion:positiveureasegenesdon’ttotallyexpressurease.KeyL无菌水溶液中,使其形成0.5麦氏单位

3、的菌悬液，从上述菌悬液中取3滴入需实验的尿素酶安瓿瓶中，然后将上述安瓿瓶置于37℃孵箱中培养24h后观察结果。1.2.3序列测定：将尿素酶表型阳性菌株枸8和枸69的ureD切胶回收，送六合通公司进行序列测定。2结果2.1ure的检测结果在所检测的枸橼酸杆菌中都存在ure。2.2尿素酶表型实验结果尿素酶实验中，其培养液的原色为橙红色，阳性反应的颜色变为玫瑰红色或红色；阴性反应的颜色仍为橙红或变为黄色。本实验阳性对照为小肠结肠炎耶尔森菌标准菌株52211，其尿素酶反应后的颜色为玫瑰红；编号分别为枸8、枸69、枸80、枸8

4、1、枸93的5株实验菌株尿素酶表型实验为阳性，其中枸69的反应液由橙红变为玫瑰红，其余阳性菌株的反应液变为红色。2.3测序菌株结果分析测序的菌株序列首先使用Chromas软件观察测序质量，而后应用软件blast在NCBI和本室建立的核糖体共有序列数据库进行比对，比对的结果根据序列的相似性程度百分比进行分类，统计信息，进行分析。3讨论尿素酶是人和动物胃肠道及泌尿道细菌感染常见的酶，它既是人和动物致病菌的致病因子之一，又是某些氮源性腐败物转化所必需具备的酶之一。它是人类首次获得晶体并发现含有Ni2+的金属酶，活性调节由活

5、性部位的镍含量决定，该酶的活性需在全酶的六个活性位点上插入Ni2+，这个插入过程由尿素酶基因簇中辅助基因编码的蛋白来完成。奇异变形杆菌、产气克雷伯菌、小肠结肠炎耶尔森菌、幽门螺杆菌等细菌中都存在ure基因，尽管基因存在差异，但尿素酶的氨基酸序列相当保守，这与尿素酶在生物体中的功能一致。尿素酶基因的表达可能与基因的调节、启动子的确定、转录的调节、mRNA的长度等密切相关。在所检测的枸橼酸杆菌中，其ure基本上都为阳性，ureD是决定尿素酶表达的关键性因素。在进行枸8和枸69尿素酶阳性实验菌株的ureD序列分析后发现：尿

6、素酶表型阳性与阴性的菌株，UreD的氨基酸方面存在差异，枸8：84位氨基酸由天冬酰胺->赖氨酸；枸69：64位氨基酸由丙氨酸->苏氨酸，71位氨基酸由亮氨酸->精氨酸，90位氨基酸由亮氨酸->缬氨酸，130位缺失谷氨酰胺。这些变异的氨基酸可能在尿素酶表达方面有重要作用。此外发现ureG对尿素酶的表达影响不大。如果将尿素酶阴性菌株的特定氨基酸进行突变，是否可促进其表达，还有待进一步的研究。这些尿素酶阳性的菌株对机体有何危害，还有待进一步的动物实验来验证；铁摄取性调节因子（fur）可增加ure基因

7、的表达，如果在反应体系中加入fur是否会增加枸橼酸杆菌中ure基因的表达，研究还需继续；ure基因簇与EHEC的O26、O111、O157血清型具有相关性，推测枸橼酸杆菌中的ure基因簇的表达与血清型也有一定关系。【参考