加味四逆散对心理应激损伤大鼠海马nnos表达的影响

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1、加味四逆散对心理应激损伤大鼠海马nNOS表达的影响【关键词】加味四逆散／药理学慢性心理应激／中药疗法脑／酶学疾病模型动物大鼠心理应激是指由于个体在生活适应过程中的对环境要求与自身应付能力不平衡的认识所引起的一种身心紧张状态。心理应激可以通过感知、情感、行为和生理机制影响健康，机体的应激机制与许多疾病的发生、发展和转归有着密切的关系。研究发现，慢性应激作用下，海马神经元会发生萎缩、甚至死亡［1］。一氧化氮（NO）在体内是一种含自由基的气体分子，易扩散，不稳定，过量的NO可生成毒性代谢产物而损害神经元［2］。本文采用免疫组织化学的方

2、法观察调肝治法方药--加味四逆散对心理应激损伤大鼠海马神经型一氧化氮合酶（nNOS）表达的影响，探讨该方抗慢性心理应激海马NO损伤的相关机理。现将结果报道如下。１材料与方法1.1动物SPF级ED公司HISTMOUSETMSP系列，859643，购自晶美生物工程有限公司）；nNOS一抗、复合消化液（博士德公司，8BA0360）1.4仪器三用电热恒温水浴箱（HHPUS，1X71，日本）；超纯水机（NPG1020499，HUMANCORPORATION，厦门）;制冰机（SANYO，SIM123，日本）；精密轮转切片机（RM21

3、35）、染色机（ST4040）、石蜡包埋机（EG1160）、摊片机（HI1220）、展片机（HI1210）、脱水机（TP1020）均由德国LEICA公司提供。1.5动物分组及给药大鼠随机分为3组：正常组（不施加任何刺激）、模型组（给予21d的随机应激刺激）、加味四逆散组（每次刺激前1h灌胃中药1次，剂量为3.38g/只），每组各8只。正常组及模型组每次灌胃等容积生理盐水。1.6慢性心理应激动物模型制备［3］电击足底（30V，电流强度1.0mA，每隔1min刺激1次，每次持续10s，共30次）、冰水游泳（4℃，5min）、夹尾（1

4、min）、禁水（24h）、禁食（24h）、限制（2h）。以上应激刺激每天1种，随机安排在21d内，第22天取材。1.7标本的制备用30g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（50mg·kg-1），开胸经左心室插管至升主动脉，先用生理盐水200mL灌注，再用250mL含40g/L多聚甲醛的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2～7.6）灌注，取脑，置于含40g/L多聚甲醛的0.01mol/LPBS中放置4～6h，常规石蜡包埋，切片，片厚4μm。1.8检测方法采用免疫组织化学法检测大鼠海马nNOS：（1）切片脱蜡、水化，PBS洗2

5、min×3次；（2）蒸馏水新鲜配置体积分数为3%H2O2，室温放置5～10min以灭活内源性酶，蒸馏水洗5min×3次；（3）滴加复合消化液，37℃作用5～10min，蒸馏水洗5min×3次；（4）滴加体积分数5%血清封闭液，室温20min，甩去多余液体，不洗；（5）滴加一抗（1：200）4℃过夜，PBS洗涤2min×3次；（6）滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃作用20min，PBS洗涤2min×3次；（7）滴加试剂链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC），37℃作用20min，PBS洗涤5min×4次；（8）联苯二

6、胺（DAB）显色：使用DAB显色试剂盒。取1mL蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下观察控制反应时间5～30min，自来水洗涤，蒸馏水洗涤；（9）苏木素轻度复染，脱水，透明；（10）封片胶（中性树脂）封片，干燥后显微镜下观察结果。试验中设立严格的阴性对照（以PBS缓冲液代替一抗）。每只大鼠选取2张切片，每张切片选取1个固定的高倍视野（40×10倍），以两种方法处理结果［4］：（1）记数阳性细胞和神经细胞的总数，计算阳性细胞所占的百分率；（2）采用半定量方法，分别按阳性细胞的分布和染色深度记分，计

7、数阳性累积分。阳性细胞的分布记分标准：０分：无着色细胞；１分：阳性细胞数少于整个组织细胞数的１／２；２分：阳性细胞数介于整个组织细胞数的１／２～2/3；3分：超过整个组织细胞数的２／３。染色深度记分标准：０分：不着色；１分：介于０分和２分之间（棕色）；２分：深染（褐色）。以２者相加分数作为阳性累积分，计算出平均值。1.9统计学方法采用SPSS11.0统计软件包进行方差分析。2结果各组大鼠海马nNOS的表达见表1和图1。结果可以看出，nNOS散在分布于正常组大鼠海马的各个区域，胞体主要呈圆形或椭圆形、梭形等多种形态，但阳性细胞数不

8、多。与正常组相比，模型组海马内nNOS表达强度显著高于正常组，阳性细胞数及阳性累积分显著增多（Ｐ＜０.０１）。加味四逆散组与正常组比较无显著性差异（Ｐ＞０.０５）;与模型组比较，海马内nNOS表达显著性降低，阳性细胞数及阳性累积分显著性减少（均Ｐ＜０.０１）。表