人胎膜体外孵育方法研究论文

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1、人胎膜体外孵育方法研究论文.freelin内进行取材，所取的胎膜位于胎盘边缘和破口之间，包含绒毛膜和羊膜两层，大小约10cm×10cm，取材之前先用生理盐水纱布尽可能擦去胎膜表面的血液，取下后立即放入装有Hanks液（4℃）的瓶中，10min内送至实验室后在超净台内把所取的胎膜放入装有Hanks液的培养皿中进行反复漂洗，直至肉眼观察无血液，再用DMEM.F-12培养液洗1次，然后把胎膜剪成24块0.6cm×0.6cm大小，放入装有DMEM.F-12培养液（含1×105U.L青霉素，0.1g.L链霉素）的24孔培养板中，每孔1块组织，加培养液2ml。

2、培养板置5%CO2、95%O2、37℃的培养箱中进行孵育，共孵育96h，每24h换液1次。孵育48h后其中的8块胎膜再分别给予脂多糖（LPS，0.1mg.L，由O55:B5型菌株产生，Sigma公司，北京中杉公司代理）和LPS+N-乙酰半胱氨酸（NAC，10mmol.L，Sigma公司，北京中杉公司代理）作用24h。1.2.2胎膜存活力检测胎膜存活力检测每24h为一个检测点，即24、48、72和96h。在每个检测点，用CytoTox96Non-RadioactiveCytotoxicity试验检测培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）含量，孵育后的胎膜用1

3、%TritonX-100计算其LDH的最大产量，胎膜存活力=100×〔（1-培养基中产生的LDH的量）.胎膜中应产生的LDH最大量〕，最后计算各时点20例孵育胎膜的平均存活力。1.2.3苏木精-伊红染色及免疫组化苏木精-伊红染色及免疫组化均增加一个0h时点，免疫组化取消了96h时点，其中72h组又分成LPS组和LPS+NAC组。每组孵育的胎膜经10%中性甲醛固定24h，石蜡包埋，4μm连续切片，经苏木精-伊红染色进行细胞的形态学观察。免疫组化采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）连接法，操作步骤按试剂盒说明进行，二氨基联苯胺（DAB）显色（MM

4、P-9单克隆一抗及SP法试剂盒为北京中杉公司产品）。用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗，按同前步骤平行操作，其染色作为阴性对照。染色阳性为细胞质出现棕黄色颗粒。采用半定量积分法，根据切片阳性细胞率和阳性细胞着色强度分别计分。阳性细胞率以计数5个高倍视野为准，≤5%计0分，6%～30%计1分，31%～50%计2分，≥51%计3分。基本未着色，染色强度与背景相似者，计0分;着色浅，略高于背景色，计1分;中等着色，明显高于背景色，计2分;强染，着色深者，计3分。两项相加得分分为4级:0～1分为阴性（-），2分为弱阳性（+），3～4分为中等强度阳性（++），

5、5分及以上为强阳性（+++）。1.3统计学处理应用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，计量资料采用t检验，染色评分的比较采用Mann-EM.F-12培养基中孵育的胎膜生长良好，换液时各培养孔中的培养液均由樱桃红色变成淡橙色，组织颜色鲜艳，有些组织边缘见有细胞生长。20例胎膜孵育后的总存活力24h为87%±1.9%，48h为85%±1.3%，72h为83%±1.6%，96h为37%±1.2%;前3组两两比较差异无统计学意义（P0.05），但每组和96h组比较差异均有统计学意义（P0.05）。2.2苏木精-伊红染色0～72h各组胎膜苏木精-伊红染色

6、后均可见大多数细胞饱满，胞膜完整无皱缩，胞质丰富，核无碎裂、固缩等细胞死亡现象，孵育96h后可见细胞开始皱缩，胞质减少，核碎裂。2.3免疫组化染色在0h及48h，孵育的胎膜中几乎不表达MMP-9，阳性细胞率分别为8%和6%，细胞质着色浅黄（图1、2）。24h时MMP-9表达增强，阳性细胞率为32%，细胞质着色黄（图3）。72h时羊膜上皮细胞及绒毛膜滋养层细胞表达MMP-9，胞质呈棕黄色;LPS组表达最强，阳性细胞率为76%，细胞质着色深棕色（图4）;LPS+NAC组表达减弱，阳性细胞率为47%，细胞质着色浅棕色（图5），其阳性率和LPS组比较有显著

7、差异（P0.05）。因苏木精-伊红染色示胎膜孵育96h后细胞开始死亡，故未作免疫组化检查。图10h时MMP-9几乎不表达（SP法染色，×100）图248h时MMP-9几乎不表达（SP法染色，×100）图324h时MMP-9弱阳性表达（SP法染色，×200）图472h时LPS组MMP-9强阳性表达（SP法染色，×300）图572h时LPS+NAC组MMP-9中等阳性表达（SP法染色，×200）3讨论胎膜主要由羊膜和绒毛膜组成，两者由富含Ⅳ型胶原的基底膜相连，由于羊膜上皮细胞和绒毛膜滋养细胞是胎膜的主要细胞，细胞排列成单层，在培养基中孵育时，可以汲取有

8、效的营养成分维持细胞的活性，从每天换液见培养基的颜色由樱桃红色变为淡橙色（说明培养基中的营养成分被吸收）以及部分胎膜的边缘