用地衣红染色法评价猪卵母细胞核成熟

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1、http://www.paper.edu.cn用地衣红染色法评价猪卵母细胞核成熟卢庆，葛立军，高俊锋，曹爱巧，剧世强，芮荣*南京农业大学动物医学院，南京（210095）E-mail：rrui@njau.edu.cn摘要：用0.1%地衣红对猪卵母细胞进行染色检查，分析不同层数卵丘细胞对卵母细胞成 熟的影响。结果显示，3层及3层以上卵丘细胞包被的猪卵母细胞核成熟率为64.7%，明显 高于3层以下卵丘细胞包被的卵母细胞或裸卵的核成熟率（分别为56.3%和33.3%）；3及3 以上卵丘细胞包被的卵母细胞卵裂率和16细胞胚发育率均为最高，分别为66.7%和37.0%。 表明卵丘细胞对猪卵母细

2、胞的核成熟及卵母细胞体外受精后的卵裂和早期胚胎发育，都具有明显的促进作用。地衣红染色检查与其他成熟判断法相比，结果比较准确、重复性好。关键词：地衣红染色，卵母细胞，核成熟，猪胚胎体外生产（IVP）主要包括卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）和其后的体外培养（IVC）等技术环节。猪IVP的效率与体内发育能力相比一直处于较低水平，其原因较为复杂，包括卵母细胞IVM不完全、精液质量不佳、多精受精或培养条件不合适等等。从后续培养的结果来看，卵母细胞的来源和成熟质量仍为影响体外生产的关键环节[1]。经过不断的技术改进，以TCM-199为基础的成熟培养液现已被广泛应用于猪卵母细胞的体

3、外成熟。在本实验室所获得的猪卵母细胞卵丘扩散率可基本稳定在80%左右；但有学者认为，卵丘扩散并不能完全代表卵母细胞成熟[2]。如何评价卵丘包被对卵母细胞体外成熟的作用，正是本实验研究的目的所在。通过用地衣红染色法分析不同的卵丘包被条件对卵母细胞成熟发育的影响，以期改进猪卵母细胞核成熟评价方法。1.材料与方法1.1猪卵母细胞采集从屠宰场采集猪卵巢，置于盛有37℃生理盐水（含青霉素、链霉素各500IU/mL）的保温瓶内，于2.5h内送达实验室。将卵巢用添加1%新生牛血清（NCS）的改良杜氏磷酸盐缓冲液（mPBS）洗3-4次后用于采卵。采用抽吸法采集卵巢表面直径2-5mm卵泡卵母细胞，用

4、带有8号或12号针头的注射器抽吸卵巢表面卵泡中的卵母细胞，抽吸的卵母细胞缓缓注入10mL离心管中，37℃静置5min，弃去上清；含卵母细胞的沉淀用少量mPBS液重新悬浮后转入10cm培养皿内，于实体显微镜下检卵。所获裸卵或卵丘-卵母细胞复合体（COC）用mPBS洗2-3次后，再用TCM199培养液1-2次备用。1.2卵母细胞体外成熟培养成熟培养液为TCM199，添加10%NCS、10%猪卵泡液（pFF）、10IU/mL孕马血清促性腺激素（PMSG）、10IU/mL人绒毛膜促性腺激素（hCG）、69µg/mLL-半胱氨酸、1µg/mL17β-雌二醇(E2)、0.36mg/L丙酮酸钠、

5、1mL/L乳酸钠、100IU/ml青霉素钠和100IU/mL硫酸链霉素[3]。采用微滴法进行体外培养，制作100µl成熟培养液滴，上盖石蜡油，在CO2培养箱内隔夜平衡。每100µl微滴中放入约15枚卵母细胞，于38.5℃、5%CO2气相和饱和湿度本课题得到上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字[2003]第14－1号)，国家自然科学基金(30270958)和 江苏省自然科学基金(BK2002108)的资助。作者简介：卢庆（1982－），硕士研究生，研究方向为动物生殖生物学。*通讯作者-1-http://www.paper.edu.cn的CO2培养箱中培养44h。1.3地衣红染色法完

6、全除去卵丘细胞的卵母细胞在PBS液中洗2次，置于2.5%戊二醛溶液中固定30s-1min。取出后移至生理盐水或PBS液中洗1-2次；在载玻片中央约为盖玻片大小的区域、相当于其4个角的位置，点上少量凡士林；将卵母细胞集中置于凡士林4个点的中央；放上盖玻片，于镜下轻压，并用生理盐水充满盖玻片。放入有乙酸-乙醇（3：1）的容器内，4℃冰箱内保存3d；期间每天取出3次过乙酸-乙醇。第3天过无水乙醇，然后以0.1%地衣红染色5min后，以乙酰甘油透明。最后指甲油封片，镜下观察。1.4卵母细胞的体外受精体外成熟的猪MII期卵母细胞脱除卵丘细胞后，以15枚为1组，移入预先隔夜平衡的50µLmTB

7、M液中等待受精。精子处理时，取1mL鲜精用2mLmPBS液离心洗涤2次，再用3mLmTBM液离心洗涤1次，最后加入含200µg/mL肝素的mTBM液，悬浮并调整精子浓度为1×106/mL，取50µL精子加入含卵母细胞的mTBM液中；精卵共同孵育6~8h后，移入隔夜平衡的100µLNCSU-23培养液中进行体外培养。培养条件为38.5℃、5%CO2气相和饱和湿度。培养48h后，检查卵裂情况，此后每天检查胚胎发育情况。1.5实验设计1.5.1卵母细胞成熟的核相变化取生发泡