adhgf对肺泡ⅱ型上皮细胞的转染表达及增殖效应

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1、AdHGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞的转染表达及增殖效应作者：哈小琴，吕同德，赵治华，唐瑜，昌业伟【摘要】目的：观察AdHGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ细胞）的转染表达及增殖效应.方法：以不同转染强度（50，100，200MOI）AdGFP转染原代培养大鼠ATⅡ细胞，感染后48h用流式细胞仪检测转染效率.并以最佳感染强度AdHGF转染ATⅡ细胞，ELISA方法检测转染后48,72h上清中HGF的表达水平.用MTT法检测表达产物对肺泡上皮细胞的效应.结果：感染强度为100MOI时，对ATⅡ细胞的转染效率已达89.61％，以100MOI的AdHGF转染6×105细胞后48,7

2、2h上清中HGF的表达分别为(249.4±1.8)ng和(168.0±26.1)ng，且表达产物对ATⅡ细胞有明显的促增殖作用.结论：AdHGF可有效转染ATⅡ细胞并在细胞中表达，表达产物对该细胞有明显的促增殖作用.【关键词】AdHGF；肺泡Ⅱ型上皮细胞；转染；基因表达；细胞增殖0引言　　肺泡上皮细胞是覆盖于肺泡表面的一层上皮细胞，分为Ⅰ型和Ⅱ型.其中肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolartypeⅡcell,ATⅡ细胞)具有重要的功能,当受到各种刺激时,ATⅡ细胞可增生并修复已损伤的上皮细胞,起着肺泡上皮干细胞的作用［1］.肝细胞生长因子（hepatocytegroAb（R

3、D），重组人HGF蛋白纯品（RD）,DMEM(Gibco),胎牛血清(Gibco)，碱性磷酸酶显色试剂（北京中山生物技术有限公司），MTT(BBI)；gSO4)中,37℃振摇4min后过100目和200目细胞筛,并用Percoll分离液进行低温（10℃）梯度离心，250g离心20min，收集细胞接种于含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，37℃50mL/LCO2培养1h后将未贴细胞转至另一培养瓶继续培养，48h时对细胞进行碱性磷酸酶染色（改良Gomori氏钙钴法）［4］鉴定.1.2.2重组腺病毒对原代培养ATⅡ细胞的转染将第二代生长旺盛的ATⅡ细胞接种至6孔细胞培养板

4、，每孔6×105细胞，次日用不同感染强度（50，100，200MOI）的AdGFP感染，感染后48h用流式细胞仪检测转染效率，选择对原代培养ATⅡ细胞的最佳感染强度.1.2.3腺病毒介导HGF在ATⅡ细胞中的表达将生长旺盛的原代培养ATⅡ细胞接种至6孔细胞培养板，每孔6×105细胞，24h后用最佳感染强度的AdHGF感染，37℃培养48,72h时分别收集上清.用ELISA检测HGF表达量.1.2.4HGF表达产物对ATⅡ细胞的作用采用MTT法测定细胞增殖活性.将原代培养ATⅡ细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为5×103个.12h后吸弃原培养液，每孔加入100μL

5、无血清DMEM,HGF表达上清所加的量分别占培养总体积的5%(80pg)，10%(160pg),15%(240pg),20%(320pg),25%(400pg),40%(640pg)和50%(800pg).72h后每孔加入20μLMTT,37℃孵育4h后，弃上清用DMSO溶解沉淀，测其波长在560nm处A值.2结果2.1原代培养大鼠ATⅡ细胞酶消化及贴壁培养法培养大鼠ATⅡ细胞，48h对细胞进行碱性磷酸酶染色，胞质中可见灰黑以至深黑颗粒状沉淀(图1).2.2重组腺病毒可有效转染ATⅡ细胞以不同MOI的AdGFP（50,100,200pfu/细胞）感染ATⅡ细胞，随着病毒剂

6、量的加大，其转染率提高（图2）.当MOI为100pfu/细胞时，转染率已近90%，表明ATⅡ细胞对重组腺病毒高度敏感；当MOI再加大时，腺病毒对细胞有一定毒性，细胞有少量漂浮现象.ATⅡ细胞感染AdGFP12h时，即可在荧光显微镜下观察到大量GFP表达阳性的细胞，随时间的推移，阳性细胞比例继续增多，GFP表达量也升高，48～72h时达高峰（图3），此后GFP表达量呈下降趋势，直至第10日时仍可见少量阳性细胞.2.3重组腺病毒介导人HGF基因在肺泡上皮细胞中的表达用ELISA方法检测AdHGF感染肺泡上皮细胞后HGF的表达，结果感染后48h表达量约为(249.4±1.8)

7、ng/6×105细胞；至72h时仍有较高的表达［（168.0±26.1）ng/6×105细胞］.这说明腺病毒介导的人HGF基因可在肺泡上皮细胞中高效表达.2.4HGF表达产物对ATⅡ细胞的增殖刺激活性采用MTT法分析了不同剂量HGF表达产物对原代培养ATⅡ细胞的作用，结果表明原代培养ATⅡ细胞表达的上清，有明显刺激ATⅡ细胞增殖的活性(P<0.05)，而且有剂量效应关系.加入20%（320pg）表达上清时刺激活性达高峰，剂量加大活性不再增加(图4).3讨论　　肺泡Ⅰ型上皮细胞(ATⅠ细胞)和ATⅡ细胞连接于同