AdHGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞的转染表达及增殖效应.doc

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1、AdHGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞的转染表达及增殖效应作者：哈小琴，吕同德，赵治华，唐瑜，昌业伟【摘要】目的：观察AdHGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ细胞）的转染表达及增殖效应.方法：以不同转染强度（50，100，200MOI）AdGFP转染原代培养大鼠ATⅡ细胞，感染后48h用流式细胞仪检测转染效率.并以最佳感染强度AdHGF转染ATⅡ细胞，ELISA方法检测转染后48,72h上清中HGF的表达水平.用MTT法检测表达产物对肺泡上皮细胞的效应.结果：感染强度为100MOI时，对ATⅡ细胞的转染效率已达89.61％，以100MOI的AdHGF转染6×105细胞后48,72h上清中

2、HGF的表达分别为(249.4±1.8)ng和(168.0±26.1)ng，且表达产物对ATⅡ细胞有明显的促增殖作用.结论：AdHGF可有效转染ATⅡ细胞并在细胞中表达，表达产物对该细胞有明显的促增殖作用.【关键词】AdHGF；肺泡Ⅱ型上皮细胞；转染；基因表达；细胞增殖0引言　　肺泡上皮细胞是覆盖于肺泡表面的一层上皮细胞，分为Ⅰ型和Ⅱ型.其中肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolartypeⅡcell,ATⅡ细胞)具有重要的功能,当受到各种刺激时,ATⅡ细胞可增生并修复已损伤的上皮细胞,起着肺泡上皮干细胞的作用［1］.肝细胞生长因子（hepatocytegrowthfactor,HGF）

3、是一多功能生长因子，在生理状态下可促进肺上皮细胞的发生、管腔形成及肺支气管上皮细胞的增生，HGF也可促进急性肺损伤的肺上皮组织增生和修复［2］.我们在前期构建的携带人HGF基因的重组腺病毒（AdHGF）［3］基础上，观察AdHGF对ATⅡ细胞的转染表达及增殖效应，为AdHGF治疗肺损伤提供依据.1材料和方法1.1材料AdHGF,携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒（AdGFP）由军事医学科学院二所三室提供，本课题组构建［3］；抗人HGFmAb（R&D），重组人HGF蛋白纯品（R&D）,DMEM(Gibco),胎牛血清(Gibco)，碱性磷酸酶显色试剂（北京中山生

4、物技术有限公司），MTT(BBI)；Wistar大鼠（甘肃省中医学院，清洁级，180～230g）.1.2方法1.2.1大鼠ATⅡ细胞原代培养Wistar大鼠腹腔注射肝素（4U/g）和异戊巴比妥钠（100mg/1004g）,无菌分离出气管及肺置于生理盐水中，用生理盐水冲洗肺动脉两次后行肺支气管插管，用8～15mL溶液A(1.3mmol/LNaCl,5.2mmol/LKCl,10.6mmol/LHepes,2.6mmol/LNa2HPO4,10mmol/LDGlucose,pH7.4)冲洗2～3次后，用2.5g/L胰酶冲洗1次，再将胰酶灌满肺（约8～15mL）,37℃消化20～30mi

5、n;剪碎肺组织置入含250mL/L胎牛血清的溶液B(A液加入1.9mmol/LCaCl2,1.29mmol/LMgSO4)中,37℃振摇4min后过100目和200目细胞筛,并用Percoll分离液进行低温（10℃）梯度离心，250g离心20min，收集细胞接种于含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，37℃50mL/LCO2培养1h后将未贴细胞转至另一培养瓶继续培养，48h时对细胞进行碱性磷酸酶染色（改良Gomori氏钙钴法）［4］鉴定.1.2.2重组腺病毒对原代培养ATⅡ细胞的转染将第二代生长旺盛的ATⅡ细胞接种至6孔细胞培养板，每孔6×105细胞，次日用不同感染强度（50，

6、100，200MOI）的AdGFP感染，感染后48h用流式细胞仪检测转染效率，选择对原代培养ATⅡ细胞的最佳感染强度.1.2.3腺病毒介导HGF在ATⅡ细胞中的表达将生长旺盛的原代培养ATⅡ细胞接种至6孔细胞培养板，每孔6×105细胞，24h后用最佳感染强度的AdHGF感染，37℃培养48,72h时分别收集上清.用ELISA检测HGF表达量.1.2.4HGF表达产物对ATⅡ细胞的作用采用MTT法测定细胞增殖活性.将原代培养ATⅡ细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为5×103个.12h后吸弃原培养液，每孔加入100μL无血清DMEM,HGF表达上清所加的量分别占培养总体积的5

7、%(80pg)，10%(160pg),15%(240pg),20%(320pg),25%(400pg),40%(640pg)和50%(800pg).72h后每孔加入20μLMTT,37℃孵育4h后，弃上清用DMSO溶解沉淀，测其波长在560nm处A值.2结果2.1原代培养大鼠ATⅡ细胞酶消化及贴壁培养法培养大鼠ATⅡ细胞，48h对细胞进行碱性磷酸酶染色，胞质中可见灰黑以至深黑颗粒状沉淀(图1).2.2重组腺病毒可有效转染ATⅡ细胞以不同MOI的AdGFP