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1、三氧化二砷对肠癌HCT116细胞Smads表达的影响冯越1蔡士昌1蔡朋朋2李雪松2孙智睿3费洪新4徐广有51.齐齐哈尔医学院2009级学生，黑龙江齐齐哈尔161000；2.齐齐哈尔医学院附属三院消化科，黑龙江齐齐哈尔161000；3.齐齐哈尔医学院附属三院心内科，黑龙江齐齐哈尔161000；4.齐齐哈尔医学院组胚室，黑龙江齐齐哈尔161000；5.齐齐哈尔医学院微形态实验室，黑龙江齐齐哈尔161000[摘要]目的研究三氧化二砷对肠癌细胞HCT116中TGF-β/Smads信号通路的Smads相关基因表达变化，阐述Smads相关基因在肠癌HCT116细胞中的变化规律，探讨肠癌发生的
2、病理机制，和分析As2O3作用新靶点。方法实验分空白对照组,低剂量As2O3组，中剂量As2O3组，高剂量As2O3组,在体外培养72h后取出细胞用于实验。采用免疫荧光化学术和PUS倒置显微镜由奥地利生产，Smads抗体购于博奥森公司，其余二抗等购于武汉博士得公司。1.2细胞培养复苏后的HCT116细胞接种于培养瓶中,加入1640培养液(含热灭活胎牛血清,2g/LNaHCO3,青霉素和链霉素各100mg/L)中，置于恒温培养箱中培养(条件为37℃，5%CO2浓度及饱和湿度)，然后用0.15%胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞用于实验。1.3分组及药物处理将5×104个/mL单细胞
3、悬液接种在96孔培养板中，其中空白对照组加10%的培养液,用于试验的低剂量组加入0.5μmol/L浓度的As2O3，中剂量组加1.5μmol/LAs2O3，高剂量组加2.5μmol/L的As2O3液,在培养72h后取出细胞用于实验。1.4间接免疫荧光术检测Smad3、Smad7蛋白的表达收集对数生长期的HCT-116细胞,用0.15％胰酶消化成单细胞悬液后,以1×105/mL细胞浓度接种在放有玻片的24孔培养板中,1mL/孔，37℃,5％CO2孵箱中培养72h,待细胞贴壁后,弃去上清液,换成无血清的培养液，继续培养48h后，吸尽上清液，PBS洗5min×3次，取出玻片，中性树胶封
4、片（有细胞面向上），过夜晾干，4℃保存备用，间接免疫荧光术检测，按试剂盒说明书进行操作（Smad蛋白抗体浓度为1∶100,荧光抗体浓度为1∶50），用荧光显微镜观察，结果以荧光强度表示。1.5ads相关蛋白表达将上述各组As2O3处理过的培养细胞,用PBS进行漂洗，裂解细胞,离心然后灌凝胶上样，将蛋白样品加入50μg/孔电泳分离，转至PVDF膜然后上摇床后用TBS封闭抗原1h，加入一抗（Smad3、Smad7）,4℃过夜，TBS洗膜后加入二抗稀释液(用封闭液进行稀释，稀释浓度为1∶2000)室温孵育膜lh，TBS洗膜3次，β-actin为参照，拍照。1.6统计方法采用SPSS12
5、.0软件对数据进行统计分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示，比较用t检验。2结果2.1免疫荧光化学术检测Smad3,Smad7蛋白表达见表1。2.2APK)通路、核转录因子-κB(NF-κB)等相互作用[9-11]，其间的更详细的因果关系以及机制有待进一步研究。.jyqkannIS，2013，121(10):967-975.[9]花芳,余娇娇,孙巍,等.TGF-β/Smad3信号参与介导TRB3的促肿瘤作用[J].中国药理学通报,2013,29(3):323-327.[10]RaoC,LinSL,WenH,etal.Crosstalkbetad?andWnt/β-caten
6、insignalingpathAPK信号通路与细胞凋亡的关系[J].中国实用医药，2010，15（5）：260-261.（收稿日期：2014-05-02）
