两种方式提取杏鲍菇菌丝胞外酶的比较分析

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1、两种方式提取杏鲍菇菌丝胞外酶的比较分析罗卫，谢纯良，严理，朱作华，李智敏，胡镇修，彭源德（中国农业科学院麻类研究所，长沙４１０２０５）摘要：为了寻找有效提取杏鲍菇（ＰｌｅｕｒｏｔｕｓｅｒｙｎｇｉｉＱｕｅｌ）菌丝胞外酶的方法，为杏鲍菇等食用菌胞外酶的活性研究和生长规律提供试验依据，研究通过ｐＨ４．８的柠檬酸缓冲液、去离子水２种处理方式提取杏鲍菇菌丝胞外酶，并通过测定８种胞外酶酶活来对这２种方式进行比较分析。结果表明，２种提取方式对杏鲍菇菌丝胞外酶的酶活有差异，其中，酸性纤维素酶和果胶酶经酸处理酶活是水处理的２倍

2、多；木聚糖酶和木质素降解相关酶类经酸处理的酶活也高于水处理，但淀粉酶和蛋白酶经酸处理酶活低于水处理。.jyqkg/kg的条件下培养，大概３５ｄ长满菌丝［６］。１．２试剂羧甲基纤维素钠、木聚糖、果胶和半乳糖醛酸为Ｓｉｇｍａ公司产品，柠檬酸、无水葡萄糖、木糖、乙酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻联甲苯胺、纤维二糖、丙二酸，丙二酸钠、ＡＢＴＳ、黎芦醇、果胶、硫酸锰、牛血清蛋白、ＰＢＳ缓冲液、考马斯亮蓝染液、酒石酸、双氧水、酒石酸甲钠、３，５－二硝基水杨酸、可溶性淀粉为国产分析纯。１．３试验方法１．３．１粗酶液制备菌丝

3、长满菌袋后，在袋中取长满菌丝的培养料充分混匀，然后取４０ｇ均匀分成２份，一份加去离子水（以下简称水）５０ｍＬ，一份加ｐＨ４．８柠檬酸缓冲液（以下简称酸）５０ｍＬ，２０℃振荡浸提４ｈ，过滤后，４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，上清液即为粗酶液。１．３．２木质素降解相关酶类酶活测定１）漆酶酶活的测定。相关试剂配置和酶活计算公式参照Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ等［７］的方法，其酶活单位定义为１ｍｉｎ催化ｌｍｏｌ底物的酶量。准确移取１００ｍｍｏｌ／Ｌ丙二酸—丙二酸钠缓冲液、０．６ｍｍｏｌ／ＬＡＢＴＳ溶液各１０ｍＬ。混合摇匀，３０

4、℃水浴。取上述混合试剂ｌｍＬ于１．４ｍＬ的比色皿中，４２０ｎｍ处调零。准确加入待测酶液ＸμＬ（Ｘ＝0～５０），立即记录吸光度。每隔３０ｓ记录１次，共３次。取平均值，折算成每分钟的吸光度变化（ＯＤ４２０变化）。２）锰过氧化物酶酶活的测定。相关试剂配置和酶活计算公式参照Ｗａｒｉｉｓｈｉ等［８］的方法，其酶活单位定义为ｌｍｉｎ氧化１μｍｏｌＭｎＳＯ４的酶量。准确移取１００ｍｍｏｌ／Ｌ丙二酸—丙二酸钠缓冲液０．５ｍＬ于１．４ｍＬ的比色皿中，加入１０ｍｍｏｌ／ＬＭｎＳＯ４溶液０．１ｍＬ，准确加入待测酶液ＸμＬ（Ｘ＝０～

5、５０），加入去离子水（４００－Ｘ）μＬ，３０℃水浴，加入浓度为１０ｍｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２溶液０．０１ｍＬ启动反应，迅速测定２７０ｎｍ处的吸光度，ｌｍｉｎ后再测定１次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化（ＯＤ２７０变化）。３）木质素过氧化物酶酶活的测定。相关试剂配置和酶活计算公式参照Ｔｉｅｎ等［９］的方法，其酶活单位定义为１ｍｉｎ氧化ｌμｍｏｌ黎芦醇的酶量。准确移取２００ｍｍｏｌ／Ｌ酒石酸缓冲液０．５ｍＬ于１．４ｍＬ的比色皿中，加入４０ｍｍｏｌ／Ｌ黎芦醇０．１ｍＬ。准确加入待测酶液ＸμＬ（Ｘ＝０～１００），加入

6、去离子水（４００－Ｘ）μＬ，３０℃水浴，加入浓度为２０ｍｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２溶液０．０1ｍＬ启动反应，迅速测定３１０ｎｍ处的吸光度，１ｍｉｎ后再测定１次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化（ＯＤ３１０变化）。１．３．３酸性纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶酶活的测定１）酸性纤维素酶酶活的测定。相关溶液和试剂的配置参照Ｍａｎｄｅｌｓ等［１０］的方法，取３支试管各加入０．５ｍＬ酸性ＣＭＣ底物，与待测酶液一起在５０℃水浴中预热５ｍｉｎ。在第一、二支试管中各加入０．５ｍＬ待测酶液，５０℃水浴中反应１５ｍｉｎ。在３支试管中各加

7、入３ｍＬ的ＤＮＳ试剂，然后在第三支试管中加入０．５ｍＬ的待测酶液。摇匀３支试管后，在沸水浴中煮５ｍｉｎ。水浴冷却至室温后，以第三支试管为对照在５４０ｎｍ下测第一、二支试管的吸光度。酶活（ＩＵ／ｍＬ）＝（葡萄糖等量值／１８０／１５／０．５）×稀释倍数。２）果胶酶酶活的测定。相关溶液和试剂的配置参照王玉万等［１１］的方法，取３支试管各加入０．５ｍＬ０．２５％聚半乳糖醛酸溶液，与待测酶液一起在５０℃水浴中预热５ｍｉｎ。在第一、二支试管中各加入０．５ｍＬ待测酶液，５０℃水浴中反应１５ｍｉｎ。在３支试管中各加入３ｍＬ的

8、ＤＮＳ试剂，然后在第三支试管中加入０．５ｍＬ的待测酶液。摇匀３支试管后，在沸水浴中煮５ｍｉｎ。水浴冷却至室温后，将空白液置４０００ｒ／ｍｉｎ离心机中离心５ｍｉｎ后取上清液作为空白对照。以第三支试管为对照在５４０ｎｍ下测第一、二支试管的吸光度。酶活（ＩＵ／ｍＬ）＝（葡萄糖等量值／１８０／１５／０．５）×稀释倍数。３）木聚糖酶酶活的测定。相关溶液和试剂的配置参照Ｓｈａｍａｌａ等［１２］的方法。采用ＤＮＳ