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1、简便有效分离培养大鼠主动脉内皮细胞的一种新毕业：肖琼 房云海 徐蕴 田铧 张立平 田兴松【摘要】目的：探索分离、培养鼠主动脉内皮细胞的有效方法。方法：将鼠主动脉内膜翻向外，结扎两端，置于50mL培养瓶中培养、传代，Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色。结果：培养6～8d时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长；12～14d时贴壁细胞覆盖大部分培养瓶面，约80%的细胞汇合成单层；传代细胞生长旺盛；细胞汇合后呈现典型的“鹅卵石”样内皮细胞特征，内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性；未见杂细胞。结论：此方法无损伤、不
2、需要酶消化，能比较容易的获得高纯度大鼠原代主动脉内皮细胞，适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。【关键词】主动脉·体外培养·内皮细胞·大鼠Aneethodforisolationandcultureoftheendothelialcellsoftherataorta【ABSTRACT】Objective:Toinvestigateamodifiedmethodofisolatingandculturingtheendothelialcellsfromtherataortaforendothelialbi
3、oresearch.Methods:Turnedinsideout,theaortaoftherat,ofatunicaLculturebottle.Results:Asmallamountofcellsmigratedoutfromtheaorta6to8daysaftercultured;themigratingcellsspreadovermostoftheculturesurfaceofthebottle12to14daysaftercultured,80%oftheminaconfluent
4、monolayer.Theconfluentcellsaticmethodofobtaininghighlypurifiedprimaryendothelialcellsoftherataorta,especiallypracticalforisolationandcultureofsmallvascularendothelialcells. 内皮细胞是研究心血管、炎症、肿瘤等疾病最常用的工具。目前，对脐静脉等较大血管原代内皮细胞的分离与培养1般采用酶消化法，技术已经成熟。但对于大鼠等小动物血管而言
5、，由于管径细小，操作难度大，其内皮细胞的分离与培养1直存在产量少、易混入杂细胞等问题［1］。本研究经过反复实验，建立了1种有效获取高纯度、高数量大鼠原代血管内皮细胞的分离与培养方法。（f,放入含有青霉素105U/L、链霉素100mg/L的D-Hanks液中，用吸管将动脉管腔残留的血液冲洗干净。缝衣针去尖,牵引手术缝合线穿过主动脉管腔，缝合线的远端就近结扎动脉的1端，血管钳牵引缝合线近端，同时用镊子轻轻反向下滑动脉，使主动脉内膜翻出，折入缝扎动脉的另1端，此时翻过来的动脉两端被完全折入封闭。将动脉置于5
6、0mL培养瓶中，加入含有20%胎牛血清的培养液，液体仅遮盖主动脉即可，置于37℃、5%CO2饱和湿度的孵育箱中培养，3d换液1次。1.2.２ 细胞传代培养 原代培养约12～14d，迁出生长的细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，约80%的细胞汇合即可传代。取出主动脉，用D-Hanks液冲洗培养瓶2次，常规消化、吹打，1000r/min离心5min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液适量，制成细胞悬液，依照细胞的量按1：1或1：2传代培养，3d换液1次。另9只大鼠以同样步骤重复上述实验。1.
7、3 免疫细胞化学鉴定 在24孔培养板内放置无菌盖玻片，每孔种植1mL含有104个细胞的悬液，待细胞生长至接近汇合时,取出盖玻片，室温下4%的多聚甲醛固定10min,常规SABC法显示血管内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原（v,inoueK,,eta1.Selectiveisolationofrataorticeactivitymeasurement[J].TissueCell,1994,26（6）:943-955.［4］KreiselD,KrupnickAS,Szetoethods,2001,254（1-2
8、）:31-45.［5］LincolnD,PhillipsPG,etal.IsolationofmurineaorticendothelialcellsIncultureandtheeffectsofsexsteroidsontheirgro,2003,39（3-4）:140-145.［6］林哲绚，罗文鸿，李慧．瞬间热处理大鼠主动脉内皮细胞分离培养法[J]．解剖学杂志，2004，27（5）：571-573．［7］李淑香，王佐周，邱雪杉．酶消化对培养脐静脉内
