整合素αvβ3受体靶向的mr分子探针制备及体外成像

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1、整合素αvβ3受体靶向的MR分子探针制备及体外成像：王小东　吴国球　居胜红　滕皋军　姚玉宇　刘乃丰【摘要】目的：构建结缔组织生长因子多肽(CTGFP)超微超顺磁氧化铁粒子(USPIOs)磁共振(MR)分子探针,以显示高表达整合素αvβ3受体人肝癌Bel7402细胞。方法：用免疫细胞化学方法检测Bel7402细胞αvβ3受体表达情况；用邻苯二马来酰亚胺(OPDM)将USPIO和CTGFP偶联；将USPIOCTGFP、USPIO分别与Bel7402细胞孵育,同时设立多肽竞争组及对照组,行普鲁士蓝染色显示铁颗粒,体外磁共振成像(MRI)观察在T2RI

2、显示USPIOCTGFP组T2弛豫时间低于USPIO组、竞争组及对照组(P＜0.05)。结论：USPIOCTGFP对αvβ3受体具有较好靶向作用,可通过MRI显示高表达整合素αvβ3受体Bel7402细胞。【关键词】结缔组织生长因子　多肽　分子影像学　分子探针　超微超顺磁氧化铁粒子　　PreparationofMRmolecularprobetargetingintegrin　αvβ3receptoranditsinvitroimaging　　Rmolecularprobeofultrasuperparamagicironoxidepartic

3、les(USPIOs)containingconnectivetissuegroanhepaticcarcinomacells(Bel7402cells).MethodsTheexpressionofintegrinαvβ3receptoronBel7402cellsmuocytochemistry.TheCTGFPandUSPIOsaleimide(OPDM).TheBel7402cellsentsandthecontrolexperimentsed.Prussianbluestainingaging(MRI)edtoobservetheT2re

4、laxationtimebyusingT2RI)由于其极强的成像能力及广泛的应用前景而受到关注,多种MR分子探针的开发成果也不断出现［23］。　整合素αvβ3受体在新生血管内皮细胞和一些肿瘤组织高表达,而正常组织不表达或低表达此受体［4］。结缔组织生长因子多肽(connectivetissuegrop;D公司),SP试剂盒及DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司),荧光倒置相差显微镜(日本Nikon公司),7.0T微型MR仪(德国Bruker公司)。　1.2方法　　1.2.1探针构建　　将0.1mgUSPIOs用0.9ml0.1mol·L-

5、1pH5.0醋酸钠缓冲液悬浮,加入0.1ml0.2mol·L-12巯基乙醇37℃反应90min。将上述溶液通过离心法(6000r·min-1)用0.01mol·L-1pH7.2PBS洗涤3次,用0.75mmol·L-1OPDM醋酸钠缓冲液500μl重新悬浮,30℃反应20min,PBS洗涤3次后,加入500μl0.4mg·ml-1CTGFPPBS溶液30℃反应20min。用0.1mol·L-1的NaOH将上述溶液pH调至7.0后置于4℃24h，PBS洗涤3次后用2%BSAPBS4℃过夜，PBS洗涤3次后用0.01%BSAPBS4℃保存。　

6、　1.2.2细胞培养和实验分组　　Bel7402细胞采用含10％胎牛血清、100U·ml-1青霉素钠、100U·ml-1链霉素的RPMI1640培养液,在37℃、5％CO2饱和湿度的条件下传代培养。将细胞传代后用6孔板或培养瓶培养,分成USPIOCTGFP组、ＵＳＰＩＯ组、竞争组及对照组4组,每组3个复孔,分别用USPIOCTGFP(20μg·ml-1)、USPIO(20μg·ml-1)、CTGFP(2mg·ml-1,预孵育30min)加USPIO(20μg·ml-1)及生理盐水孵育1h后行普鲁士蓝染色和MRI检查。　　1.2.3免疫细胞化学检

7、测　　用链霉卵白素过氧化物酶检测法,染色步骤严格按照试剂盒说明书进行,阴性对照以PBS代替一抗。　　1.2.4普鲁士蓝染色　　将细胞用PBS洗涤3次,用4％多聚甲醛固定20min,普鲁士蓝反应液(等体积20％盐酸水溶液与10％亚铁氰化钾临时混合)孵育30min,蒸馏水洗涤3次,0.5％中性红复染3min,再蒸馏水洗涤3次,最后在荧光倒置相差显微镜下观察铁染色情况。　　1.2.5体外MRI　　将细胞用PBS洗涤3次,0.25％胰蛋白酶消化液消化,PBS洗涤并重悬于10%凝胶中,置于1.5mlEpendof管中行MR扫描。采用多层多回波序列,TR10

8、00ms,TE100ms,层厚1.5mm,FOV3.5cm,atrix=256×256,用T2map人工画感兴趣区，计算T