荧光pcr常见问题----荧光曲线无相关性

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1、荧光PCR常见问题…-荧光曲线无相关性小新作为技术员，在进行SYBRGreen荧光PCR吋也会经常碰到和顾客们-，样的问题，好好的实验，结果荧光跑完了会出现一些奇怪的荧光曲线，那么面对这样的结果，我们应该怎么来分析呢？接不來，小新带大家看一些“不规矩”的荧光曲线，并一起來分析分析原因。首先来看这种荧光曲线：///////y■——'—■——■f一一---13579111315171921232527293133353739看到这一堆乱七八糟的线是不是就头大？实际上这些样本是存在一定的浓度梯度的【小新是按照10倍、100倍、1000倍这样稀释的】，然而这些样本在实验

2、结果上看不出相应的差异，并且有些线在PCR后期会出现下降的趋势。这样的结果基本上显示了样本DNA浓度过高，因为荧光PCR仪检测到荧光存在一个阈值【小新采用的这款仪器，它开始能够接受的荧光起始值围绕在15左右】，如果DNA浓度过高的话，在进行PCR扩增的前面几个循环，仪器就己经开始能够检测到荧光，导致所有的曲线全都堆积在一起，无法分开。面对这种情况，小新建议大家多稀释一些梯度【扩大稀释倍数也可啊】，努力做到让曲线分开。第二种曲线乍看上去非常正常IL^iidrxrivb13579111315171921232527293133353739有木有觉得很完美？？？！！！

3、//但是如果小新告诉大家，这两条线其实有一个是阴性对照，你们是不是就懵圈了呢?实际上的样本是这样的!肯定有小伙伴说你肯定在逗我吧！其实出现这种线的情况并不少见，多存在于荧光PCR的引物测试过程屮。巾于引物设计的不完美，导致PCR扩增过程屮出现引物二聚体。当然除了看荧光曲线以外，还可以用融解曲线为佐证（不知道啥是融解曲线的小伙伴可以自行百度，度娘解释的很清楚哟！）。从图上就可以明显看出阴性对照与阳性对照的峰值并不在一起，也就是说阴性对照出现非特异性扩增，这个阴性的峰值就是引物二聚体的融解温度。所以小伙伴们在做正式的荧光PCR实验之前，一定要记得进行引物测试，以免遇

4、到这种情况哦！最后一种曲线就相对简中.的多了接下来再看看它们的融解曲线（毫无章法的任性曲线大部分小伙伴看到这种曲线的第一反应就是：这明显是阴性对照嘛！是的，图上这三条曲线的样本均为阴性测试但是这三条线在结尾还是出现了起线，我们在一般惜况下也视为阴性，那么它山现起线的主要原因是什么呢？巾于扩增体系中Mg离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数等多重因素都会导致这种现象的发生。其次酶量过多有时也容易出现非特异性扩增。好啦，今天的小新课堂讲述了好多新的科普知识，希望小伙伴们在学习的过程中也能够和小新多多交流，小新欢迎大家来信对小新课堂进行评价和指导！（毕竟小新也是

5、个爱好学习的好孩纸！这是小新的邮箱：technical@simgen.cn记得给我来信哦。么么口达！