荧光定量pcr常见问题与解答

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1、荧光定量PCR常见问题与解答1、什么是定量PCR？以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。2、定量PCR定量的理论依据是什么？特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。理想的扩增结果：Y=X×2n其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数；理论上PCR扩增效率为100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA

2、的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长；实际应为：Y=X(1+E)n，其中E代表扩增效率：E=参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X在1～105拷贝、循环次数n≤30时，E相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加（>30次），E值逐渐减少，Y呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。3、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么？PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得PCR扩增终产物的数量与原始模板

3、数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来研究人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量PCR方法，即荧光定量PCR。PCR扩增通式：①Tn=T0（1+E）n②Tn=Tn-1（1+E）n注：[0

4、也就是K=T0（1+E）CP，取对数即：lgK=lgT0+CP*lg(1+E)CP=-1/lg(1+E)*lgT0+lgk/lg(1+E)由于对一特定的PCR而言，E与K均为常数，故上式为循环数（CP）对原始模板拷贝数的对数（lgT0）一次方程，其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为-1/lg(1+E)，在横坐标上的截距为lgk/lg(1+E)，也是荧光定量PCR所谓的标准曲线。例如下图为单管实时荧光定量RT-PCR的标准曲线：目前荧光定量PCR均采用外标定量外标法定量PCR扩增效率的计算，由于标准曲线的斜率(Slope)为-1/lg(1+E)，可知E=10-1/Slo

5、pe-1,如从标准曲线中知道Slope=-3.337,则可推知扩增效率E=101/3。337-1=0.99,也有作者将(1+E)直接视为扩增效率E，则E=10-1/Slope，求得的E值均在1—2之间，有时也有大于2的结果，如下图所示。另外也可直接根据系列稀释外标在该次实时荧光PCR的结果来大略分析扩增效率的高低，例如系列10倍稀释外标在PCR扩增时有N2=N0En2,N3=(10*N0)En3,在扩增到指数期时荧光值相同则代表此点的终末拷贝数相同，即N2=N3，En2-n3=10,取对数得到⊿ngE=1,E=10l1/⊿n，E=2，⊿n=3.32;E=1.8，⊿n=3

6、.91.反之亦然。如图所示。4、定量PCR可以分成哪几类？根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为四种方法：定量PCR根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为四种方法：①有限稀释法，即倍比稀释法：通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止，来设置已知浓度的参照品；根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数；利用最大稀释度来进行标本核酸定量时的注意点A、PCR产物的最低可检测极限须有重复性；B、对每个稀释度必须作多次PCR，一般先对模板DNA作10倍连续稀释

7、后作PCR，首先找到PCR结果呈阴性的接近稀释点，然后再对各稀释度作系列的2倍稀释，每个稀释点作5次PCR；C、必须严格控制污染。优点：不需要特殊设备；缺点：扩增反应条件的标准化、严格注意污染，避免假阳性的产生。②使用外参照物的定量PCR，以已知浓度的目的基因为模板，按一定的倍比稀释，然后做出标准曲线图，未知的标本按这标准曲线找出对应的拷贝数。荧光定量PCR通常使用该法做标准曲线。荧光定量PCR通常使用该法做标准曲线。③使用非竞争性内参照物的定量：PCR反应条件同样，在同一试管内，用两对引物，同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标