临床荧光pcr结果分析及常见问题

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1、临床荧光PCR结果分析及常见问题中国人民解放军三零二医院王海滨一、荧光PCR技术在临床诊、疗中的应用PCR技术是于1983年由Mullis发明，后来传到我国，但是由于实验污染的问题，1998年卫生部取缔PCR实验方法在临床诊断中的应用。荧光PCR出现后，污染减少很多，但近几年由于磁珠的应用，污染又再起。2003年，PCR在SARS的早期诊断中非常有效，当时使用的是电泳法。H1N1甲型流感（2009）：荧光PCR技术作为确诊指标（755份/天）。疾病易感基因的研究（SNP）：CR1/丙型肝炎IL-28B。疾病（肿瘤）易感基因的鉴定。二、影响临床荧光PCR检测结

2、果的因素（一）影响临床荧光PCR检测结果的常见因素1.检验因素：实验室硬件、仪器、试剂、人员素质、技术水平、管理水平。2.非检验因素：标本采集、质量、部位、标本保存、条件、时间、标本中的干扰物质、样本丢失！（二）加强检测前标本的质量管理——避免问题重复发生规范标本前处理流程、制度化的重要性，建立不合格标本记录和定期总结制度、制定解决措施与可行路径（编号和项目错误等），查找标本丢失可能的环节。加强本室新进工作人员流程培训，经常性进行临床医护的交流与培训。（三）实验室分区分为：试剂配制、核酸提取、PCR扩增以及开放产物分析等区域。分区目的：通过物理分割达到标本、

3、试剂或使用器具等被沾染或掺入污染，标本间的交叉污染等。分区要求：至少要有清洁的试剂配制和核酸制备区三、试剂配制（一）试剂配制室的设置与维护以空间内无核酸气溶胶为准！1．正压、清洁进风(壁挂式空调)。试剂冰箱内勿存放病原或核酸相关物品！定期清洁除霜！2．有效氯消毒液清洁实验室台面、地面。3．移液器：使用前的清洁。4．离心机等：每周定期木浆纸巾擦拭，方法。“一次性物品的使用-从COBAS的“浪费”中找到均衡！（二）试剂配制注意事项试剂配制实际是简单的问题，但是也是非常复杂的环节。1.何时配制？如何配制！在核酸制备好后再进行试剂配制，注意反复冻溶对试剂质量的影响，

4、以及久配不用试剂对检测的影响(如hot-TaqE)。2.如何避免荧光淬灭？避免在强光下配制，采用有效氯消毒液后应进行通风或清水擦拭，勿在紫外灯下配制。3.交叉污染的避免试剂与核酸何者先加更合理？试剂分配中的问题：过吸、残滴（第一孔）。热盖不能完全阻止蒸发，石蜡油，盖、膜、离心。（三）试剂配制环境对检测的影响PPT8显示的是试剂配制环境对检测的影响，左边的图，是实验室在装修的时候用了一些油漆，在那个环境里面配制的试剂。右边的图，是在无油漆环境下配制的。可以看到左边的图结果很差。（四）核酸制备冻存标本使用前要混匀离心后使用；不同类型标本：血清、血浆、细胞、组织、

5、乳汁、痰液、尿液等；标本核酸提取前后的保存；提取后核酸的保存（稳定性）；核酸提取标本加入量与核酸得率的关系！1+1与2的关系；指示剂的引入，可以降低差错率。PPT10显示的是指示剂在一管法的应用，可以看到上面蓝色的是核酸提取液，非常清楚，降低了差错。四、荧光PCR扩增（一）实验室怎么建？独立区域、负压通风、物品专用：1.实验室清洁用品的专用的重要性。2.扩增产物的处理（PCR管加盖、封膜、石蜡油），用两层封口袋包装后焚烧（如PPT12图）。产物的处理必须由专业工作人员或经过培训的工作人员处理。禁止未经培训的研究生、实习生和进修生进入区域对扩增产物进行操作。3

6、.仪器清洁处理程序：载板区先用70%乙醇清洁。该区所有垃圾需封闭运输并销毁。4.地面和空气处理原则。（二）荧光PCR仪器如何选择？PCR实验室的仪器非常多有几十种，应按照实验的要求不同来进行选择。（三）荧光PCR仪器如何维护？荧光PCR仪器的功能模块分为三个：1.温度模块包含最基本的升降温。要保证温度模块的均一性，既不能有边缘效应，也不能有局部温度的影响。2.光学模块即测光系统，PCR反应的过程中每一个循环都要测一次光，测光不论是照相还是扫描，都有一定的差别，光学模块的敏感性要高。3.软件模块荧光信号采集以后，要用软件模块来进行分析。分析不但要人性化，而且还

7、要准确，不能有故障。（四）荧光PCR扩增循环数量的选择（60:50:40cycles）COBASTAQMAN用的是60个循环，早期是40个循环，近几年的荧光PCR试剂，循环数有所增加，如丙肝增加到45个循环，乙肝42个循环。PPT16显示的是实验室的图，扩增的循环数量是40个。（五）质控品的设立-没有质控就没有质量保证对一个完整的实验，一定要注意有空白对照，阴性对照与临界对照，临界对照是对精密度的考核。另外，有平行定量标准品。如果试验测的是血清，质控标准品也应该是血清，而不是人造核酸。质控品在结果报告中的应用非常重要：1.空白对照一般放在第一孔的位置，监控扩

8、增试剂及环境污染。2.阴性对照第二孔位置，监控核酸提