欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:18084820
大小:2.45 MB
页数:17页
时间:2018-09-13
《临床荧光pcr结果分析及常见问题》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、临床荧光PCR结果分析及常见问题中国人民解放军三零二医院王海滨一、荧光PCR技术在临床诊、疗中的应用PCR技术是于1983年由Mullis发明,后来传到我国,但是由于实验污染的问题,1998年卫生部取缔PCR实验方法在临床诊断中的应用。荧光PCR出现后,污染减少很多,但近几年由于磁珠的应用,污染又再起。2003年,PCR在SARS的早期诊断中非常有效,当时使用的是电泳法。H1N1甲型流感(2009):荧光PCR技术作为确诊指标(755份/天)。疾病易感基因的研究(SNP):CR1/丙型肝炎IL-28B。疾病(肿瘤)
2、易感基因的鉴定。二、影响临床荧光PCR检测结果的因素(一)影响临床荧光PCR检测结果的常见因素1.检验因素:实验室硬件、仪器、试剂、人员素质、技术水平、管理水平。2.非检验因素:标本采集、质量、部位、标本保存、条件、时间、标本中的干扰物质、样本丢失!(二)加强检测前标本的质量管理——避免问题重复发生规范标本前处理流程、制度化的重要性,建立不合格标本记录和定期总结制度、制定解决措施与可行路径(编号和项目错误等),查找标本丢失可能的环节。加强本室新进工作人员流程培训,经常性进行临床医护的交流与培训。(三)实验室分区分为
3、:试剂配制、核酸提取、PCR扩增以及开放产物分析等区域。分区目的:通过物理分割达到标本、试剂或使用器具等被沾染或掺入污染,标本间的交叉污染等。分区要求:至少要有清洁的试剂配制和核酸制备区locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayone
4、ts,duetomissedfatal,whennightcame三、试剂配制(一)试剂配制室的设置与维护以空间内无核酸气溶胶为准!1.正压、清洁进风(壁挂式空调)。试剂冰箱内勿存放病原或核酸相关物品!定期清洁除霜!2.有效氯消毒液清洁实验室台面、地面。3.移液器:使用前的清洁。4.离心机等:每周定期木浆纸巾擦拭,方法。“一次性物品的使用-从COBAS的“浪费”中找到均衡!(二)试剂配制注意事项试剂配制实际是简单的问题,但是也是非常复杂的环节。1.何时配制?如何配制!在核酸制备好后再进行试剂配制,注意反复冻溶对试剂
5、质量的影响,以及久配不用试剂对检测的影响(如hot-TaqE)。2.如何避免荧光淬灭?避免在强光下配制,采用有效氯消毒液后应进行通风或清水擦拭,勿在紫外灯下配制。3.交叉污染的避免试剂与核酸何者先加更合理?试剂分配中的问题:过吸、残滴(第一孔)。热盖不能完全阻止蒸发,石蜡油,盖、膜、离心。(三)试剂配制环境对检测的影响PPT8显示的是试剂配制环境对检测的影响,左边的图,是实验室在装修的时候用了一些油漆,在那个环境里面配制的试剂。右边的图,是在无油漆环境下配制的。可以看到左边的图结果很差。(四)核酸制备located
6、intheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame冻存标本使用前要混匀离心后使用;不同类型标本:血清、血浆、细胞、组织、乳汁、痰液、尿液等;标本核酸提取前后的保存;提取后核酸的保存(稳
7、定性);核酸提取标本加入量与核酸得率的关系!1+1与2的关系;指示剂的引入,可以降低差错率。PPT10显示的是指示剂在一管法的应用,可以看到上面蓝色的是核酸提取液,非常清楚,降低了差错。四、荧光PCR扩增(一)实验室怎么建?独立区域、负压通风、物品专用:1.实验室清洁用品的专用的重要性。2.扩增产物的处理(PCR管加盖、封膜、石蜡油),用两层封口袋包装后焚烧(如PPT12图)。产物的处理必须由专业工作人员或经过培训的工作人员处理。禁止未经培训的研究生、实习生和进修生进入区域对扩增产物进行操作。3.仪器清洁处理程序:
8、载板区先用70%乙醇清洁。该区所有垃圾需封闭运输并销毁。4.地面和空气处理原则。(二)荧光PCR仪器如何选择?PCR实验室的仪器非常多有几十种,应按照实验的要求不同来进行选择。(三)荧光PCR仪器如何维护?荧光PCR仪器的功能模块分为三个:1.温度模块包含最基本的升降温。要保证温度模块的均一性,既不能有边缘效应,也不能有局部温度的影响。2.光学模块即测光系统
此文档下载收益归作者所有