拟smac作用下膀胱癌t24 细胞增殖及凋亡的研究

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1、拟Smac作用下膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的研究引言Smac/DIABLO蛋白（线粒体促凋亡蛋白）自被发现以来，经过几年的研究已经成为细胞凋亡研究中的一个热点。近年来，国内外很多学者将其应用于泌尿系统肿瘤研究和治疗，并认为Smac/DIABLO及由它衍生而来的小分子多肽及其类似物将为未来泌尿系统肿瘤的治疗开辟一个新领域[1]。纳米技术作为近年来出现的高技术新兴科学，由于其表现出现的各种特性，有利于医学及其各个分支的研究，特别是对肿瘤的早期诊断和治疗有着显着的意义。　　本文将二者相互联系，通过合成的拟Smac多肽磁性纳米粒作用于膀胱癌T24细胞，探讨其对膀胱癌T24细胞的增殖及凋亡的影

2、响2.材料与方法2.1试剂拟Smac合成肽羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物（SmacN7-O-CMC-MNPS）由前期实验制备合成。MTT溶液、Hoechst33258染色试剂盒购自武汉凌飞生物公司。抗Bcl-2、Bax、β-actin单克隆抗体购自美国cellsignal公司。RPMI1640培养基及胎牛血清购自美国GIBCO公司。　　其他常用生化试剂购自美国Sigma公司。　　2.2细胞培养与实验分组实验设正常对照组（A）、单纯SmacN7-O-CMC-MNPS组（B）和SmacN7-O-CMC-MNPS加磁场组（C）。膀胱癌T24细胞用含10%的胎牛血清的RPMI1640培

3、养基培养于5%CO2的37℃培养箱中，待细胞生长至对数期时用无血清1640洗涤2次，每孔滴加0.5μmol/L的SmacN7-O-CMC-MNPS，C组磁场为8mT。转染4h后加入含胎牛血清的1640培养基继续培养。　　2.3MTT检测细胞增殖参照MTT试剂盒使用说明。以细胞密度约104/孔接种于96孔板，按照上述实验分组，每组设置4个复孔，每孔100ul，按照不同分组加入药物，继续培养24h、48h、72h后采用MTT法检测细胞增殖活性，绘制细胞增殖率变化曲线，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖率=实验组A490nm/正常对照组A490nm100%，（A为吸光度值）细胞增殖抑制率=

4、（1-细胞增殖率）100%。TBST洗膜10min3次，加ECL发光，X胶片曝光，洗片，收集数据。　　2.7统计学分析所有数据均以x±s表示，采用SPSS15.0统计软件处理，不同处理组间差异采用ANOVA或DuntT-test，P<0.05为差异有统计学意义。　　3.结果3.1SmacN7-O-CMC-MNPS联合磁场能显着抑制膀胱癌T24细胞增殖及诱导凋亡和对照组相比，SmacN7-O-CMC-MNPS转染膀胱癌T24细胞后和SmacN7-O-CMC-MNPS加磁场组均不同程度地出现肿瘤细胞生长抑制和凋亡；而SmacN7-O-CMC-MNPS磁性纳米颗粒外加磁

5、场对T24细胞的生长抑制作用和诱导凋亡作用更明显。　　3.2SmacN7-O-CMC-MNPS联合磁场对膀胱癌T24细胞凋亡相关基因的mRNA及蛋白表达的影响在外磁场条件下，SmacN7-O-CMC-MNPS转染膀胱癌T24细胞24h、48h、72h后采用RealtimeRT-PCR及C-MNPS转染膀胱癌T24细胞的作用更明显，这说明外磁场条件下SmacN7-O-CMC-MNPS磁性纳米颗粒能透过膀胱癌T24细胞细胞膜，通过干扰凋亡信号传导通路诱导细胞的凋亡。　　4.讨论Smac/DIABLO在胞浆中合成最初的前体蛋白含239个氨基酸，分子量为27KD，SmacmRNA全长1.5K

6、b。全长的Smac/DIABLO蛋白没有任何活性，必须在线粒体内进行信号肽的切除后才能获得促凋亡生物活性。Smac/DIABLO参与细胞凋亡的死亡受体通路和线粒体通路的下游反应，通过竞争性地结合凋亡抑制蛋白IAPs解除对caspase的阻遏而促进凋亡的发生。Smac/DIABLO蛋白衍生的含AVPI四肽结构的小分子多肽也具有重要的抗肿瘤效果。研究表明，Smac/DIABLO小肽与载体蛋白结合并转染细胞后可以使体内和体外化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡效果明显增加。Smac/DIABLO蛋白通过干扰凋亡信号转导通路，促进肿瘤细胞凋亡，抑制其过度增殖。（fac是一种新型的线粒体促凋亡蛋白，其N

7、端的AVPI四肽发挥着重要的促凋亡作用。本实验通过合成拟Smac多肽羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物，在外加磁场下作用于膀胱癌T24细胞，实验数据显示，外加磁场的诱导下SmacN7-O-CMC-MNPS磁性纳米颗粒能发挥拟Smac合成肽的抑制肿瘤细胞增殖及促凋亡作用，且外加磁场作用更为明显。而且，SmacN7-O-CMC-MNPS磁性纳米颗粒是通过调控凋亡相关基因Bcl-2，Bax来影响肿瘤细胞的活性。　　综上，本实验首次将人工合成促凋亡多肽制成磁性纳米颗粒Sm