茶多酚诱导膀胱癌t24细胞凋亡及上调pten表达

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1、茶多酚诱导膀胱癌T24细胞凋亡及上调PTEN表达作者：应荣彪，瞿海江，姚俊，胡哲，黄海涛【摘要】目的探讨茶多酚(TP)抑制膀胱癌细胞生长的可能分子机制。方法采用MTT法和流式细胞术，观察膀胱癌细胞系T24经不同浓度TP处理后细胞生长及PTEN蛋白表达的改变。结果TP以剂量依赖的方式抑制膀胱癌细胞的生长，加入0、50、100、200、400μg/mLTP的T24细胞抑制率分别为0%、11.2%、33.4%、36.9%、67.5%。流式细胞仪直方图上可见亚二倍体峰，癌细胞出现凋亡，凋亡率分别为6.8%、25.1%、28.6%、

2、36.6%、41.1%；同时，随TP作用浓度的增加，G1/S阻滞细胞逐渐增多，细胞分裂增殖指数(PI)降低；而细胞PTEN蛋白表达水平由(37.66±0.49)逐渐增加至(163.92±3.36)(P<0.01)。结论TP对T24细胞生长具有抑制作用，其机制可能是通过上调PTEN蛋白表达影响细胞周期和诱导细胞凋亡。【关键词】茶多酚；膀胱癌；凋亡；PTEN蛋白茶多酚(TP)是茶叶中最具有抗肿瘤活性的酚类化合物。研究发现，茶及TP能抑制膀胱癌发生和发展［1-2］。本实验用TP作用于体外培养的膀胱癌T24细胞株，观察TP对

3、膀胱癌T24细胞株生长及其PTEN蛋白表达水平的影响，探讨TP抑制肿瘤细胞株生长的可能分子机制。1材料与方法1.1材料T24细胞株，购自中国科学院上海细胞生化研究所；TP购自中国茶叶研究所；鼠抗人PTEN为美国MBI公司产品，RPMI1640培养液、四甲基偶氮唑盐(MTT)、0.25%胰蛋白酶为美国Sigma公司产品，羊抗鼠IgG为美国Zymed公司产品，10%小牛血清购自杭州四季青生物公司，硫氰酸荧光素(FITC)为北京金山生物有限公司产品，流式细胞仪为美国BD公司产品。1.2方法1.2.1膀胱癌细胞株T24的培养膀胱泌

4、尿上皮癌细胞T24株于含10%小牛血清的RPMI1640培养液(内含青霉素、链霉素10万U/L)中37℃、5%CO2培养至细胞对数生长期，进行实验。1.2.2MTT法观察用含10%小牛血清的RPMI1640培养液，分别将2种对数生长期的膀胱癌细胞调配成5×104/mL的单细胞悬液，接种于96孔板(0.2mL/孔)。设空白阴性对照组及不同浓度(50、100、200、400μg/mL)的TP组，各设5个平行孔，培养48h，实验终止前4h加入MTT液(5mg/mL)10μL/孔，反应完毕弃上清液加入DMSO100μL/孔溶解沉淀

5、，轻轻振动后用波长570nm的酶联仪测定各孔的A值，求出生长抑制率IR=(1-用药组平均A值/对照组平均A值)×100%。上述所有实验均重复3次。1.2.3流式细胞仪测定(FCM)取对数生长期的膀胱癌细胞，取1×106/mL细胞接种到96孔培养板(0.2mL/孔)，每组3孔。加入不同浓度的TP，并各设2个平行组为TP组；加入等体积生理盐水的RPMI1640细胞培养液为对照组。培养48h后，以0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，TP组和对照组分别进行下列检测。①细胞周期的检测：PBS洗涤2次，加入10mg/LRnaseA2

6、00μL，水浴30min，碘化丙啶染色30min，4℃避光。FCM检测细胞周期，并计算细胞分裂增殖指数(PI)=(S+G2M)/(G1+S+G2M)×100%。②癌细胞PTEN表达强度的检测：平行组和对照组分别加入鼠抗人PTEN20μL，PBS洗涤5min，共洗3次；分别加入1∶40稀释的羊抗鼠IgG-FITC抗体20μL，37℃孵育30min，PBS冲洗5min，共洗3次；4℃孵育30min后，FCM检测膀胱癌细胞PTEN的表达，以荧光强度的几何均数表示。③细胞凋亡率(APO)检测：平行组和对照组分别用Cellegues

7、t软件分析，根据细胞fl2荧光分布直方图(fl2为接收波564-606)获取阳性标记细胞的凋亡率。上述所有实验均重复3次。1.2.4统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示，运用SPSS10.0软件进行分析，组间比较采用t检验。2结果2.1TP抑制膀胱癌细胞生长及对细胞增殖周期的影响TP处理48h后，T24细胞随着TP浓度从0μg/mL升到400μg/mL，其生长抑制率从0增加至11.2%、33.4%、36.9%、67.5%，TP的浓度与其生长抑制率呈现明显的正相量效关系。FCM分析发现：G1期细胞所占细胞周期的百分比随

8、着TP浓度的增加而增加，S期和G2M期细胞逐渐减少；同时随着TP浓度的增加，PI值逐渐减小，提示细胞分裂增殖活动逐渐减弱，细胞各周期中的变化也显示一定的量效关系(表1)。2.2TP诱导T24细胞凋亡碘化丙啶染色FCM检测可见在正常G1期峰前出现不同于细胞碎片图形的亚二倍体峰(凋亡峰)，目前认为此峰的出现