甘蓝型油菜gpat6基因的克隆与功能分析

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1、甘蓝型油菜GPAT6基因的克隆与功能分析第一章文献综述1.1植物GPAT酶GPAT是三酰甘油生物合成的限速酶[1],主要负责将酰基转移到G3P的sn-1位置上形成溶血磷脂酸(Lysophosphatidicacid，LPA)。定位于质体的GPAT酶以acyl-ACP为酰基供体，定位于内质网和线粒体的GPAT酶以acyl-CoA为酷基供体[2]。溶血磷脂酸酰基转移酶将acyl-CoA的醜基转移到LPA的sn-2位上形成粦脂酸(Phosphatidicacid,PA)[5]。PA在磷脂酸憐酸酶的催化下，去磷酸化

2、形成二酰甘油(Diacylglycerol,DAG),DAG在二酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerolacyltransferase，DGAT)的催化作用下，结合第3个醜基，形成三醜甘油(Triacylglycerol，TAG)[6]。三醜甘油是植物种子中含量最多的脂类。目前有关植物GPAT基因的研究已在多种植物中展开。1.2植物基因家族成员GPAT基因已从多种植物如拟南芥(、豌sativum)南瓜（Q/cesculentum)岡、蓝莉(Echiumvulgare)、油桐(Jatlatifolium

3、)⑴中被克隆。目前在拟南芥中己经发现基因家族有10个成员，分别为ATS、AtGPATl、AtGPAT2、AtGPAT3、AtGPAT4、AtGPAT5、AtGR4T6、AtGPAT7、AtGPATS和不同成员的定位大不相同，定位于质体[8]、AtGPAn/2/3定位于线粒体[12]、GE47V/5/d/7/8/9定位于内质网。..1.3醜基转移sn-2位特异性随着研究的进一步深入，发现GPAT酶除了具有将酷基转移到G3P的sn-l号位上形成LPA的功能之外[二3〖g2324]，还能将酰基转移到G3P的sn-

4、2位置上，产生sn-2LPA或sn-2-单醜甘油（sn-2monoacylglycerolsn-2MAG)8]。目前，具有这一特性的GPAT酶只在陆生植物中被发现。因此，研究者们将这一类酶命名为陆生植物特异性GPATs。为了区分具有这一特性的GPAT酶，生化分子生物学国际联合酶学命名委员会为其给出了一个新的EC编号EC2.3.1.198。体外酶活性实验表明AtGPATl、AtGPAT4、AtGPAT5、AtGPAT6、AtGPAT7和AtGPAT8都具有sn-2酷基转移活性。此外，AtGPAT4、AtGPA

5、T6和AtGPAT8还具有磷酸酶活性，因此其摧化主要是sn-2MAG，而非sn-2LPA。AtGPAT2和AtGPAT3是否有sn-2酰基转移活性尚未经实验证实，蛋白质结构模型和活性位点序列比对、预测结构表明AtGPAT2和AtGPAT3可能具有sn-2酰基转移特性。由于sn-1单酷甘油的热力学稳定性比sn-2单酰甘油高，因此，植物体内sn-2单酰甘油不到sn-1单酰甘油的1/3。至于sn-2单醜甘油能否赋予聚酯独特的性能优势？或者sn-2单体能为聚酷提供特异的识别信号使其进入特定的生物途径或聚集场所？或者

6、仅仅是因为其与sn-1酰基化合物结构不同而进入不同的代谢途径？这些问题都有待于进一步通过生物学研究来解答。第二章基因的克隆与序列分析2.1材料和方法试剂：西班牙Bioerase购自北京全式金生物有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒以及DNAse购于索莱宝生物公司；PMD19-TTA克隆载体购自大连TaKaRa公司；在华大基因合成PCR引物；其他常用试剂购自上海国药，均为分析纯。仪器：eppendorfPCR仪、eppendorf移液器、eppendor搞速离心机、-80°C超低温冰箱、pH

7、计、电泳仪、分光光度计、凝胶成像系统、烘箱、恒温振荡培养箱、恒温水浴锅等。2.2结果与分析将RT-PCR扩增基因产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示引物对BnGPAT6F_129367.3)基因的相似度分别为84.7%和85.3%，BnGPAT6-1与BnGPA丁6-2之间的相似度达到89.1%。用MEGA5.0对白菜CBra005137.Bra017137)、甘蓝和甘蓝型油菜⑶o基因。(2)基因在花中大量表达，在未成熟的种子中表达量呈倒V形；表达量在干旱、6-BA和高盐胁迫下均发生变化，受ABA抑制，不

8、受水渍的影响。(3)基因在酵母中表达，改变了酵母的脂肪酸组分。(4)基因在拟南芥种子中特异表达，改变了拟南芥中子各脂肪酸成分的比例，同时降低了种子含油量。............