蜂毒素溶血过程及溶血生化机理研究

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1、蜂毒素溶血过程及溶血生化机理研究蜂毒素(/l^//ff/Z7)是新一代抗耐药病菌抗生素的重要候选分子，具有很强的广谱抗菌消炎活性，但因具有溶血副作用而限制了其应用，在保留抗菌活性基础上消除其溶血活性是当前研究的重点与方向。蜂毒素对脂质体、人工合成磷脂双层膜及天然质膜的作用机理已经建立了蜂毒素在磷脂双层膜的穿孔模型，并被认为是蜂毒素溶血机制。蜂毒素对红细胞的作用过程及生化机理尚不明晰，不能全面阐明其溶血机理。我们以荧光素FFTC标记蜂毒素分子，借助激光共聚焦扫描显微镜动态观察它们作用红细胞的整个过程，并以扫描电镜观察分析蜂毒素处理后的红细胞表面情

2、况。通过深入研究蜂毒素与维持红细胞结构和功能的重要酶与蛋白(阴离子转运蛋白、Na+/K+-ATP酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)的相互作用机理，构建了蜂毒素溶血生化机理模型，探索了蜂毒素溶血活性的分子基础及生化基础，为蜂毒素序列改造及其溶血活性的消除提供理论依据。蜂毒素对血红细胞膜上及胞质中酶和蛋白的生化作用关系研究也将为其临床医学研究与应用提供有益的参考。同时蜂毒素作为小分子抗菌肽研究中的模式分子，其研究成果对于其他抗菌肽的研究也有一定的借鉴意义。在激光共聚焦扫描显微镜观察试验中，我们发现荧光素FITC标记的蜂毒素迅速包围红细胞，吸附到细胞表面，

3、该过程由静电作用介导。lOmin后细胞表面从圆盘边缘部位开始破损，破损程度和蜂毒素浓度与红细胞浓度的比值相关，达到一定比值时红细胞完全裂解。蜂毒素溶血过程的激光共聚焦扫描观察糙。红细胞扫描电镜图(a、c:正常红细胞；b、d:蜂毒素处理红细胞)以SPQ为荧光探针测定带3蛋白阴离子转运活性、钼蓝法测定Na+/K+-ATPasC活性、分光光度计测定葡萄糖-6-隣酸脫氢酶(G-6-PD)活性，我们分别研究了蜂毒素与带3蛋白、Na7K+-ATPaSe及G-6-PD的相互作用机理。基于这些研究，我们构建了蜂毒素溶血生化机理模型，并探讨了该模型与蜂毒素分子特

4、性的相关性。带3蛋白G-6-PD增强带3蛋白活1促使红细胞内环境酸化，钠钾泵•抑制钠钾泵，打NADPH静电结合G-6-P、NADP等分子，抑制G-6-PD活性，破坏红细胞还原系统，并干扰红细胞糖代谢.破红细胞渗透平衡.低浓度蜂毒素处理的红细胞，在扫描电镜下呈凹陷不规则形状，表面摺皱粗蜂毒素溶血的生化机理模型1）蜂毒素C端吸附带3蛋白负电荷糖化基，N端影响带3跨膜域疏水区及膜脂流动性，促使阴离子转运活性显著增强，引起红细胞内环境酸化。2）在蜂毒素附着血红细胞质膜或游离于反应溶液的反应条件下，Na+/K+-ATPasc活性均受到抑制，后者的抑制可通

5、过加入EDTA得到部分解除。蜂毒素一方面插入质膜促使Na'/K'-ATPasc二聚体解离，破坏酶结构，另一方面通过正电荷残基与ATP产生静电吸引，跟Na+/K+-ATPasc竞争底物，抑制其活性，从而引起红细胞内离子环境失衡。3）蜂毒素抑制G-6-PD活性，当其浓度达到或大于lOpnol/L时强烈抑制，加入EDTA可迅速解除部分抑制。蜂毒素并不破坏G-6-PD二聚体，而是通过与G-6-PD竞争底物G-6-P及辅酶NADP来抑制G-6-PD活性的。蜂毒素抑制G-6-PD活性从而阻碍红细胞HMP途径，损害红细胞还原系统。