水溶苯胺蓝褪色光度法测定壳聚糖的含量

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1、水溶苯胺蓝褪色光度法测定壳聚糖的含量马卫兴　王敏　朱鹏　周亚文【摘要】目的建立壳聚糖的含量测定新方法。方法利用分光光度法研究壳聚糖与水溶苯胺蓝的超分子反应条件，并建立分析方法。结果在pH2.21时水溶苯胺蓝与壳聚糖发生了超分子褪色反应，所拟方法用于壳聚糖的测定，结果与溴甲酚绿法一致。结论所拟方法简单，快速，用于壳聚糖的测定结果准确、可靠。【关键词】壳聚糖；水溶苯胺蓝；光度法　　壳聚糖(CTS)是自然界中唯一的碱性多糖，它是天然产物甲壳素经化学法处理脱乙酰基后的产物〔1〕，其安全无毒，因分子中含有丰富的亲水性氨基和羟基而具有良好的生物活

2、性、生物相容性、易成膜性和配位性等而具有多种用途，应用范围广泛，因有保健作用而用作保健品。目前，测定壳聚糖含量的方法有茜素红S荧光熄灭法〔2〕、电化学法〔3，4〕和光度法〔5～9〕。但未见水溶苯胺蓝用于壳聚糖的测定。实验发现，在pH=2.21时，壳聚糖与水溶苯胺蓝能形成在610nm处有最大褪色吸收的超分子复合物，详细研究了反应条件，建立了测定壳聚糖的新方法，用于保健胶囊中壳聚糖的测定，结果与溴甲酚绿法〔5〕一致。　　1仪器与试剂722N可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；BS-210型万分之一的电子天平（北京赛多利斯天平有限公

3、司）。100μg/ml的壳聚糖标准溶液：称取0.1000g壳聚糖，置于烧杯中，用0.5mol/L的醋酸溶解，转入1000ml容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀，备用；5×10-4mol/L水溶苯胺蓝溶液：称取水溶苯胺蓝0.1844g，置于烧杯中加水溶解，转入500ml容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀，备用；pH=2.21Britton-Robinson缓冲液〔10〕。　　2方法　　准确移取适量100μg/ml的壳聚糖标准溶液，置于10ml的洁净比色管中，依次加入0.75ml5×10-4mol/L水溶苯胺蓝溶液，2.00mlpH=2.21Br

4、itton-Robinson缓冲液，再用水定容至刻度线，摇匀。同时配制试剂空白溶液，以测定溶液为参比，用1cm比色皿在波长610nm处测定试剂空白的吸光度A。　　3结果与讨论　　3.1测试波长的选择　　准确移取100μg/ml的壳聚糖标准溶液1.0ml，置于10ml的洁净比色管中，以下同“方法”项下操作,在波长为500～700nm范围内测定溶液的吸光度，并绘制吸收光谱；同时配制试剂空白溶液，同样绘制吸收光谱，结果如图1所示，以水为参比时试剂空白水溶苯胺蓝的最大吸收波长在600nm处，以水为参比的测定液的最大吸收波长在570nm处，而以

5、测定液为参比的相应试剂空白的最大吸收波长在610nm处，说明壳聚糖与水溶苯胺蓝之间的反应是褪色反应，褪色的最大吸收波长与水溶苯胺蓝相比，仅红移10nm。故选择610nm为测试波长。　　3.2pH的影响　　通常显色反应中酸度或pH是影响反应的重要因素之一。为此考察了pH值对反应的影响。对于在“方法”项下，其它条件不变，仅改变试液的缓冲溶液pH值，结果如图2所示，结果发现随着体系pH的升高，体系的吸光度逐渐变大；pH在1.89～2.36范围内体系的吸光度最大且稳定。当pH大于2.36是吸光度变小。故选择测试波长的选择pH=2.21Brit

6、ton-Robinson缓冲液来控制体系的酸度。实验还发现pH=2.21Britton-Robinson缓冲液用量在0.50～1.25ml内时体系吸光度最大且稳定，故选用1.00ml。　　3.3试剂用量的影响　　水溶苯胺蓝作为壳聚糖的褪色标记试剂，它的加入量直接影响反应体系中超分子复合物的生成，对于100μg/ml的壳聚糖来说，在“方法”项下，其它条件不变，仅改变水溶苯胺蓝溶液的用量，实验结果如图3所示，随着水溶苯胺蓝用量的增加，体系的吸光度逐渐增大；当其用量在0.75ml时体系的吸光度最大且稳定；当其用量超过1.00ml时体系吸光度

7、反而变小。故选用0.75ml5×10-4mol/L水溶苯胺蓝溶液作为壳聚糖的标记试剂。　　3.4时间的影响　　对于100μg/ml的壳聚糖来说，在“方法”项下，其它条件不变，仅改变反应时间，结果表明，体系的吸光度稳定不受时间影响。　　3.5工作曲线及线性范围　　在一组10ml的比色管中，分别准确加入浓度为100μg/ml的壳聚糖标准溶液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20ml，依次加入0.75ml5×10-4mol/L水溶苯胺蓝和1.00mlpH=2.21Britton-Robinson缓冲液。以下按“

8、方法”项下操作测定610nm处的吸光度A，并绘制工作曲线，结果如图4所示，其工作曲线的回归方程为A=0.004901C(C的单位为μg)+0.00310,相关系数R=0.9989，壳聚糖在10～120μg/10ml内服从