单核苷酸多态和胃癌侵袭相关性地研究

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1、·中文论著摘要·单核苷酸多态与胃癌侵袭相关性研究目的胃癌是世界最常见的第四大肿瘤，其死亡率在肿瘤中排名第二位，尽管诊断及治疗的进步，进展期胃癌患者的预后仍然很差。基因因素在胃癌的发展过程中扮演重要角色，因此，寻找和检测与胃癌侵袭及预后相关的分子标记对胃癌的防治具有重要的意义。单核苷酸多态性(SNPs)是在基因组水平由单个核苷酸的变异所引起的DNA多态性，有望作为生物标记物用于肿瘤的风险评估、筛查、分期及预后的预测。单体型是SNPs不同等位基因由于连锁不平衡(LD)形成的非随机组合，作为一个整体遗传给子代，是关联研究的重要手段。应

2、用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MAI．DI．TOFMS)进行基因分型已有报道接近100％精确，目前被看做是金标准，应用其对福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPETS)来源的DNA进行基因分型已被证实是可靠的且可重复的。我们研究了两个与肿瘤侵袭转移密切相关的基因，肝素酶是目前唯一已知的可降解硫酸肝素多糖的哺乳动物内切酶，可能参与了肿瘤细胞的运动、侵袭，以及新生血管形成等诸多与肿瘤侵袭转移相关的环节，为肿瘤防治提供了一个新的靶点。关于HPSE的SNPs的研究目前并不多，Ostrovsky等发现肝素酶基因某些$NPs位点与肝素酶

3、表达水平相关，这为我们接下来的关联研究提供了理论基础。非转移性细胞l基因(NMEl)是首个被发现的肿瘤转移抑制基因，针对胃癌的研究发现NMEI基因表达下调与胃癌细胞高侵袭转移能力，尤其是淋巴结转移密切相关．近来，对于NMEl启动子的研究越来越得到重视，Qu等报道NMEI启动子区rs2302254和rs3760468次要等位基因能够改变DNA．核蛋白质的结合能力及方式，从而影响启动子活性。在目前的研究中，我们收集了中国北方汉族人群中404例胃癌术后患者FFPETsl提取的DNA样本，并收集匹配的404例健康个体外周血提取的DNA样

4、本，利用MALDI．TOFMS进行基因型分析，目的为研究肝素酶基因和NMEl基因单个SNPs位点及其构成的单体型与胃癌易感性、临床病理特征及预后的相关性，以寻找功能性SNPs及单体型作为预测胃癌侵袭能力及预后的分子标记，这对胃癌的防治具有重要的意义。方法1、实验标本收集病例组标本来源为404例胃癌患者术后石蜡包埋正常胃组织，对照组标本来源为年龄性别与病例组一比一匹配404名健康人外周血。2、基因组DNA提取福尔马林固定的石蜡包埋组织应用QIAamp@DNAFFPE提取试剂盒(德国)提取DNA，外周血DNA提取应用TaKaRa全基

5、因组DNA提取试剂盒，依说明书描述操作。3、基因分型我们使用MALDI．TOFMS方法进行基因分型，针对每一个SNP分别设计正向引物、反向引物、延伸探针，按样品数的1％加入阴性对照，按样品数的1％N入室内质控标准品对照，按样品数的5％随机选取样品做为重复实验复核。基因型分析的操作人员不知道所检测标本的病例或对照属性。4、统计分析统计分析用PASWStatisticslg．0(SPSS，Inc．，Somers，NY，USA)软件进行．应用了贮检验，置换检验，非条件性logistic回归模型，Kaplan-Meier生存分析，log

6、-rank检验，单因素和多因素Cox回归分析。并使用Haploview4．2软件评估位点间连锁不平衡(LD)及构建单体型，使用Haplo．states评价单体型和病理特征的关系，使用THEsias软件进行单体型生存分析。结果l、肝素酶基因SNP位点及单体型与胃癌发生无关2病例组6个SNPs位点各等位基因频率、基因型频率及6个常见单体型频率与对照组相比无显著性差异。2、肝素酶基因SNP位点与胃癌细胞分化及胃癌预后相关rs4364254Tl"基因型携带者与TC+CC基因型携带者相比更易发生高分化和中分化的胃癌病理类型。在单变量生存分

7、析中，我们发现携带rs4693608AA基因型的患者与携带AC．rmG基因型的患者相比有更差的胃癌特异性生存率；在多变量生存分析中，我们发现携带rs4693608从或rs4364254TT基因型的患者与它‘们各自的变异型基因型相比，均表现出更差的胃癌特异性生存率。3、肝素酶基因CA单体型与胃癌大体类型、淋巴结转移及预后相关单体型CA(由rsl1099592和rs4693608组成)与单体型TCr+CG相比在大体类型3和4型中有更高的分布；与NO组相比，单体型CA与单体型CG相比在N3组有更高的分布；在单体型的生存分析中，单体型C

8、A与单体型CG相比有更差的胃癌特异性生存率。4、NMEl基因SNP位点及单体型与胃癌发生无关病例组5个SNPs位点各等位基因频率、基因型频率及4个常见单体型频率与对照组相比无显著性差异。5、NMEl基因SNP位点野生基因型及野生单体型与胃癌高淋巴结转移风险相关携