hgprt基因缺陷型骨肉瘤细胞系lm9的建立及其生物学特性测定

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1、HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞系LM9的建立及其生物学特性测定作者：彭磊，王臻，徐华梓，吴银松，赵艳玲，孟国林，张志培【摘要】目的建立次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）基因缺陷型骨肉瘤细胞系LM9，进行细胞形态、生长特性及致瘤性等生物学特性检测。方法应用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）诱导骨肉瘤细胞系LM8突变，用8-单杂鸟嘌呤（8-AG）筛选HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞系LM9；观察细胞形态、细胞核型分析、细胞生长周期等生物特性，接种C3h鼠观察致瘤性。结果突变后细胞仍具有典型的成骨肉瘤细

2、胞特征，细胞异型性明显，染色体众数为64-66，接种鼠具有成瘤性，成瘤率为100%。结论本实验建立了HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞系LM9，具有典型的鼠源性骨肉瘤细胞特征，可用于杂交瘤、肿瘤疫苗等多方面的研究，是一个较好的实验工具。【关键词】次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因缺陷型骨肉瘤细胞系Theestablishmentofhypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase-genedefectosteosarmacelllineageandassessmentofitsb

3、iologicalcharacteristics【Abstract】ObjectiveToestablishtheHGPRT-defectosteosaracelllineage，anddeterminetheabilityofsaragenesisandfusion.MethodsN-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)utationofanosteosaracelllineage(LM8)，thenculturingmixedorphousandcellcyclesbi

4、ologyinoculatedintomiceandthEirgroice.ResultsTheLM9celllineagehastypicalcharacteristicsofosteosaracellsanditissaragenictoC3hmice.ConclusionTheLM9cellslineageethodofmutation，itistypicalofosteosaracellscharacteristicsandhasaprospectofbEIngusedintumorvaccineandoth

5、erresearches.【Keyl/L小牛血清的RPMI1640完全培养液放在37℃，50ml/LCO2孵箱中培养，对数生长期时，用2.5mg/L的胰酶（含2mg/L的EDTA）消化、离心、调整细胞数后传代、接种。1.1.2动物及饲养4～6周龄C3h鼠8只（第四军医大学实验动物中心提供），雌性，体重17～25g。1.2方法1.2.1致突变及筛选LM8系细胞取对数生长期1.0×106/瓶，单层，培养基为RPMI1640，向瓶中加入2μg/ml的MNNG完全培养液作用15h后，除去致突变液，用PBS冲洗，胰蛋白酶(0.

6、05%)+EDTA(0.02%)1:1混合消化，制备细胞悬液，接种1×103/瓶，培养10天，细胞生长汇合后，传代，以3×103数/瓶密度继续接种，24h后，向培养液中加10μg/ml的8-AG培养液，培养24h待细胞汇合，传代，更换不含8-AG的筛选液培养基继续培养，细胞接近半汇合时，冻存。1.2.2突变细胞系LM9鉴定取对数生长期细胞LM8和LM9接种于培养瓶中，次日加入1%HAT完全营养筛选液，用倒置显微镜观察细胞的生长情况。细胞形态观察：收集对数生长期细胞0.01M的PBS洗2次2000rpm×10min离心

7、收集细胞，弃上清，以4%的pH7.4的戊二醛固定，按电镜标本常规制备方法，进一步固定，包埋，超薄切片，铅-铀染色JEM-2000型投射电镜观察。1.2.3细胞生长特征调整突变细胞浓度按1×104接种于24孔板，置37．5℃5%孵箱培养，每个样品重复3次，连续计数8天，以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。1.2.4流式细胞仪分析细胞周期测定培养细胞以0.1MPBS液(pH7.4)洗2次，悬溶于190μg结合缓冲液中调整细胞浓度为1×106/ml，加10μl异硫氰酸荧光素(PTIC)标记的连接素(Am

8、exin)和10μl的20mg/L的普匹碘氨（PI），混合均匀，避光室温孵育10min，结合缓冲液洗1次后用CouterElite流式细胞仪（Coulter公司）进行分析细胞周期情况。1.2.5体内致瘤性观察调整细胞浓度为5×105接种于10只小鼠右下肢皮下待皮下出新肿瘤结节时，按图2电镜观察细胞核大有异型性，核眼明显，染色质分散，稍聚于核膜，